分离和鉴别转基因单克隆细胞的方法.docVIP

分离和鉴别转基因单克隆细胞的方法 　　稳定转染后，要想得到外源基因整合到宿主细胞染色体组中，并能稳定表达靶基因的单克隆细胞，需要在带有抗生素的选择培养基中对多克隆进行有限稀释法的分离培养，丝裂霉素 C 处理的饲养细胞对单个细胞的营养和支持作用十分关键，然而个别饲养细胞在培养过程中可能复燃从而混入单克隆细胞中，导致单克隆分离扩增的失败。而传统的单克隆检测需要设计多对覆盖外源基因结构片段的引物，多次重复进行提取核酸再做 PCR、电泳等，耗时费力。本文针对以上关键步骤进行改良优化，利用无饲养细胞(nofeeder cells)的改良分离培养基进行了单克隆的分离和培养，并结合荧光素酶报告基因快速检测法，从多克隆中迅速有效的筛选出转染成功的单克隆。本文中介绍的稳定转染(电穿孔法)后单克隆细胞的筛出策略大大提高了检出效率，缩减时程和耗材，减免了多次重复筛选的人力物力。改良法有效缩短实验研究周期，能为临床和科研提供简捷可靠的单克隆纯化和鉴定的手段，以下进行详细介绍。 　　1　方法与步骤 　　本研究使用悬浮生长的 T 淋巴细胞系Jurkat 做为转基因靶细胞，利用电穿孔稳定转染法的高电压 (270 V 电压，950mu;F 电容和 0.4 cm 的放电杯，Bio RAD 电穿孔仪)将外源人工合成的质粒导入 Jurkat 细胞中，经过约1w 的含抗生素分离培养基(潮霉素 Hygrimycin B 浓度为 40mu;g/ml)的筛选培养，初步得到整合有携带抗性基因标记质粒的多克隆细胞，而将外源基因未整合入基因组的不稳定转染的细胞多数筛除。将细胞计数并利用有限稀释法稀释，一传统组含有丝裂霉素C(40mu;g/ml，30 mins，Sigma)处理的悬浮Jurkat 饲养细胞浓度为 1.5times;104/ml，96 孔培养板中每孔含约 200 mu;l 加有饲养细胞的选择培养基并含有一个候选靶细胞，其中 16 个对照孔不含候选单克隆细胞，每板设置8 孔阴性对照为未加有丝分裂原处理的原始细胞，培养过程中由于潮霉素的作用一直缓慢平稳增殖，而另外8 孔加入致死量高浓度丝裂霉素 C 处理的 Jurkat 做阳性对照，培养过程中会提前全部凋亡，阴阳对照做为饲养细胞的生长参照。另一改良组培养基无饲养细胞成分，培养基来自一天前换液传代的同种 T 淋巴细胞的离心后(1500 rpm，10min)的培养上清，当时其上清供体细胞的浓度为 1.5times;105/ml。两组培养板每 2 天半量换液 100 mu;l，传统组使用新鲜配制的RPMI-1640(Sigma，10% FCS)悬浮细胞专用培养基，新鲜加入潮霉素B 至 40mu;g/ml，改良组仍然加入含有等量抗生素浓度的离心后细胞的培养上清100 mu;l。显微镜观察两组细胞培养的各孔，直到发现分裂增殖的细胞克隆，多数孔单细胞凋亡，将发现的存活并扩增成功的单细胞分别渐次移入48 孔、24 孔、6 孔培养板和25 cm 培养瓶中，逐步扩增数量。荧光素酶报告实验的基础是转入T 淋巴细胞的外源质粒表达的是含有 GAL4 的融合蛋白能够与荧光报告质粒上的 GAL4 结合位点作用启动荧光素酶的表达，因此只要细胞荧光活性增强则表明荧光素酶的启动子被激活，细胞中成功转染了特定标签的外源基因，荧光素酶与底物反应产生的荧光素可用 Luminometer 检测与待测外源蛋白的作用强度成正比。将扩增好的候选的多个单克隆、转染靶基因的多克隆及空白对照的 Jurkat 细胞用pFR-Luc 荧光质粒进行 DEAE- 葡聚糖介导法转染，在荧光测定仪上检测 100mu;l 荧光报告裂解缓冲液(Promega)的荧光活性，用蛋白含量(Beckman DU640，750nm)校正得到相对荧光活性单位。对比二者方法的单克隆得率%，同时对只含有 Feeder 的阴阳对照培养孔观察分析，是否两周时间全部凋亡或仍然稳定增殖中，来判断培养条件是否稳定有效。 　　2　结果与分析 　　2.1　传统法和改良法的独立三次单克隆化存活细胞克隆比较 　　对传统法和改良无饲养细胞法分离单克隆的可操作性进行比较，进行了三次独立的培养，如方法与步骤中介绍，首先用电穿孔法稳定转染靶基因质粒进入 T 淋巴细胞系Jurkat，经过一周抗性筛选在潮霉素分离培养基中初步得到存活的多克隆细胞。有限稀释后在96 孔板中培养，传统的饲养细胞法每 96 孔板设立 8 个阴性和 8 个阳性对照，改良的无饲养细胞法每个 96 孔板中设立 8 个孔为阴性对照，换液时只添加含选择抗生素的RPMI-1640 培养基，非含丰富细胞刺激生长因子的无细胞培养上清。因此第一次培养传统法 3 块 96 孔板含单细胞孔为240 个，第二次5 块96 孔板400