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关于鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化 　　鸡蛋蛋清、蛋白中蛋白质含量高达13%~15%，富含多种对人体有益的蛋白质。鸡蛋蛋清、蛋白所含人体必需氨基酸的种类多，配比平衡性好，是生物利用效率最高的一类蛋白质。鸡蛋蛋清、蛋白质的黏度大，热稳定性差，且含有卵类黏蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等过敏性蛋白，其应用范围因此而受到限制。水解可以降低蛋清、蛋白的相对分子质量，减小致敏性，生成的多肽混合物更有利于人体吸收，与原蛋白相比，其水解产物的黏度、溶解性及起泡性等功能特性得到了改善，且具有抗氧化、降血脂、降血压等生理活性。单酶水解鸡蛋蛋清、蛋白存在水解度不高、蛋白残留量高、蛋清肽得率低和易产生苦味肽等缺点，因而，研究者尝试用多酶水解来解决上述问题。由于单一蛋白酶水解蛋白质具有专一性，所以，蛋白酶的单一使用使底物中相应的肽键断裂，联合使用则因为酶作用位点之间产生互补而降低蛋白残留量，提高水解度，增加蛋清、蛋白肽得率。笔者研究protamex、neutrase、flavourzyme组合和alcalase、flavourzyme组合水解蛋清、蛋白的水解物的性能，将能降低水解液苦味的端肽酶Flavourzyme作为水解蛋清、蛋白最终加入的酶，以优化多酶同时水解及分阶段水解的参数，旨在为蛋清、蛋白多酶水解工艺的优化提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　鸡蛋为市售鲜鸡蛋。 　　商业酶protamex、neutrase 0.8 L、alcalase 2.4 LFG和flavourzyme 500MG购自诺维信公司。所用试剂为浓硫酸、硫酸铜、无水硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、盐酸、甲基红ndash;溴甲酚绿指示剂、甲醛、30%过氧化氢等。 　　1.2 主要仪器与试剂 　　主要仪器：HSndash;4(B)型恒温浴槽(成都仪器厂)、722 可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、KDNndash;04B 消化炉( 上海新嘉电子有限公司) 、KDNndash;04B 定氮仪(上海新嘉电子有限公司)、SHAndash;C水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)、5810R离心机(德国艾本德(Eppendorf)股份公司)、79ndash;2 磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)、PBndash;21 pH计(德国Sartorius 赛多利斯)、Waters 600 高效液相色谱仪(配备2487 紫外检测器、Empower 工作站，美国Waters 公司)、Ag1100 安捷伦液相色谱仪(美国安捷伦公司)。 　　1.3 方法 　　1.3.1 水解前处理 　　将新鲜鸡蛋洗净，用75%的乙醇棉球擦拭蛋壳，使用漏勺分离蛋清、蛋黄，用灭菌蒸馏水将蛋清稀释至一定浓度(浓度以V 蛋清∶V 水表示)，95 ℃加热变性20 min，用HCl 或NaOH 调节至一定pH供水解。 　　1.3.2 水解 　　在反应温度条件下水浴预热后，加入所需酶，于恒温水浴振荡器(120 r/ min)中进行水解反应。水解反应期间用pH 计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH 溶液来调节pH，使pH 保持在一定值。于设置的水解时间收集蛋清、蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20 min，使水解反应终止。水解方式分为2 种： 　　1) 将最适温度和pH 相近的蛋白酶(protamex、neutrase、flavourzyme 3 种酶，下文用“P+N+F”表示)同时加入进行水解，水解温度设定为55 ℃，酶总量设定为6%，针对水解时间、pH、酶比例和蛋清浓度4 个因素进行正交设计。 　　2)对于最适温度和pH 相差较大的蛋白酶alcalase 和flavourzym(下文用“Andash;F 表示”)，在alcalase 的最适温度(55 ℃)和最适 pH(7.5)条件下反应一定时间后，将反应底物溶液调至flavourzyme 的最适温度(55 ℃)和最适pH(6.0)，再加入flavourzym进行水解。alcalase、flavourzyme 分阶段水解蛋清、蛋白的酶总用量设定为6%，针对蛋清浓度、酶比例和水解时间3 个因素进行正交试验。 　　1.3.3 测定指标及方法 　　1) 水解度的测定。总氮含量测定采用凯氏定氮法，由凯式半自动定氮仪测得。氨基氮含量测定由甲醛滴定法测得。 　　水解度=氨基氮含量/总氮含量。 　　蛋白残留率=离心沉淀物的含氮量/总氮含量。 　　2) 蛋清、蛋白水解物相对分子质量的测定。将蛋清、蛋白水解物溶液经0.45 mu;m微孔过滤膜过滤后上TSK gel 2000色谱柱，以细胞色素C(MW12500)、抑肽