Daxx对K562细胞向巨核细胞分化的抑制作用.docVIP

Daxx对K562细胞向巨核细胞分化的抑制作用 　　白血病是严重危害人类生命健康的血液系统恶性肿瘤，其生物学特征表现为细胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡过程发生障碍，因而导致分化异常细胞大量增殖。抑制白血病细胞增殖、促进白血病细胞分化和凋亡，是治疗白血病的基本途径。死亡结构域相关蛋白(deathdomain-associatedprotein，Daxx)是一种受体胞浆死亡结构域结合蛋白，在凋亡、转录调控、病毒感染等方面发挥重要作用。Daxx可以通过结合DNA结合转录因子、E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等参与基因表达的调控，Pax和Ets转录因子均和多种类型细胞的分化活动有关，Daxx可能通过影响转录因子来调控细胞分化。Daxx通过结合转录因子E2A，抑制E2A的功能，进而抑制肌细胞生成，参与肌细胞分化过程。Daxx基因在白血病细胞中广泛表达，人急性白血病(acuteleukemia，AL)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)及其它恶性血液病细胞内均可见Daxx表达。而Daxx在这些血液病中的具体作用机制，目前研究不多。Daxx在白血病细胞中的广泛表达，是否与白血病细胞的分化有关，目前未见相关报道。本实验以K562细胞为研究对象，初步研究Daxx与K562细胞向巨核细胞分化是否存在相关性。 　　材料和方法 　　1主要试剂 　　K562细胞株由嘉兴学院医学院提供;DMEM培养液和新生牛血清购于HyClone;Daxx购于Sigma;G418购自Amresco;兔抗CD41和CD61购自BD;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium，NBT)购自杭州昊鑫生物科技有限公司;RNA逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司;蛋白marker购自Thermo;Lipofectamine2000购自Invitrogen。 　　2主要方法 　　2.1细胞培养K562细胞株由本室保存，常规传代培养。采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养。 　　2.2稳定过表达Daxx的K562细胞系(Daxx-K562)的建立取对数生长期K562细胞接种于6孔板中，每孔用50mu;L无血清DMEM培养基稀释1mu;gGFPDaxx质粒和GFP-空载质粒(GFP-Daxx质粒和GFP-空载质粒由嘉兴学院潘巍巍博士提供);采用50mu;L无血清DMEN培养基稀释1mu;LLipofectamine2000，混匀静置5min;将质粒与Lipofectamine2000混合后室温静置20min，分别接种于培养板。置于37℃、5%CO2培养箱中48h，荧光显微镜观察表达情况。换液，加G418后继续培养。G418筛选2周后，有限稀释法获得单个荧光表达细胞，继续培养，建立GFPDaxx-K562细胞。 　　2.3实时荧光定量PCR实验TRIzol法提取各组总RNA，按试剂盒步骤逆转录后，选用10mu;L体系进行荧光定量PCR。反应条件:95℃5min;95℃30s，55℃30s，72℃40s，40个循环。 　　2.4CCK-8法检测细胞活力在96孔板中接种GFP-Daxx过表达组细胞和对照组细胞悬液，培养24h后，每孔加入10mu;LCCK-8，37℃孵育2h，酶标仪测定450nm波长附近的吸光度。每组4个复孔，重复3次。 　　2.5流式细胞术收集佛波酯(phorbol12-myristate13.acetate，PMA)处理72h后的GFP-Daxx过表达组和对照组细胞，连同PMA未处理组细胞，PBS洗2遍，收集10000个细胞，PBS稀释到50mu;L重悬细胞后加入1mu;LPE标记CD61抗体或CD41抗体，室温避光静置30min，预冷PBS洗涤2次后上机检测。 　　2.6NBT还原实验取经PMA作用72h后的GFPDaxx过表达组和对照组细胞，与2g/L的NBT溶液混合，37℃孵育30min后离心涂片，Giemsa染色，光学显微镜下观察胞质内含蓝灰色颗粒的阳性细胞。 　　2.7Westernblot实验收集细胞，预冷PBS洗涤3次后加入RIPA细胞裂解液，冰上放置30min，4℃13000times;g离心30min，收集上清，BCA法蛋白定量。取30mu;g总蛋白进行SDS，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h。后加入相应I抗4℃孵育过夜，加II抗室温孵育2h。最后用ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。 　　3统计学处理 　　用SPSS16.0统计软件进行分析。数据均采用均数plusmn;标准差(meanplusmn;SD