核酸分子杂交技术.ppt

核酸分子杂交技术 李如波 中国医科大学法医学院 6. 体外转录法 先把DNA片段克隆到有噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸核糖核苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，所谓启动子(promotor)，又称启动基因，是入出境DNA分子上可与RNA聚合酶特异性结合而使转录开始的部位，而启动子本身并不被转录。 体外转录常用的噬菌体转录启动子有沙门氏菌噬菌体SP6和大肠杆菌噬菌体T3，T7。当二个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，而且互相呈相对方向时，则可分别启动插入DNA片段Sense和Antisense的转录。 转录前要用限制酶先在cDNA插入点的下游切割，使DNA直线化，做为模板，以标记的三磷酸核糖核苷为原料，转录合成RNA探针。 原位核酸分子杂交技术 参考书目 原位 PCR设计及基本步骤 3.1设计思想 原位PCR的设计思想就是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。 PCR是在DNA聚合酶的作用下，经过模板变性、特异性引物与模板退火和引物延伸三种温度的热循环，将特异性靶序列迅速扩增（参阅第1章）。PCR技术的敏感性极高，细胞内单拷贝或低拷贝数的靶序列经PCR扩增后（一般能扩增105一107倍），就很容易用凝胶电泳或Southern印迹杂交检测。PCR技术不仅敏感性高。特异性强，而且还由于耐热DNA聚合酶的应用及自动化热循环仪的研制成功，使PCR操作简便易行。但是PCR是在液相中进行的。PCR扩增前，要把细胞破坏，从中提取核酸做为模板。 因此很难把PCR的结果与组织细胞的形态结构特征联系起来，也很难判定含特异性靶序列的细胞类型。 原位杂交是分子杂交与组织化学技术的成功结合。它用标记的DNA或RNA为探针，能在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。运用原位杂交技术，在显示阳性杂交信号的同时，还能判别含有靶序列的细胞类型，以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。但有时候，原位杂交的应用受到其敏感性的限制。一般拷贝数较高的序列较易被检出，而细胞内单拷贝DNA序列和低于10—20拷贝的RNA序列，则不能被原位杂交检出。 原位PCR的待检样本一般需先经化学固定，以保持组织细胞良好的形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性，PCR扩增所必需的各种成分，如引物、DNA聚合酶、4种三磷酸核昔等进入细胞内或核内、以固定的DNA或RNA为模板，在原位进行扩增。PCR反应在由细胞膜组成的“囊袋”内进行。而扩增产物因分子较大，或互相交织，不易透过细胞膜向外弥散，所以能保留在原位。经过PCR反应，原来细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列呈指数扩增。这样就很容易应用原位杂交技术将其检出。原位PCR综合了PCR技术和原位杂交的特点，既能检出细胞内单拷贝或低拷贝的DNA或RNA序列，而且同时还可对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。 3.2 设计方案 从严格的定义讲，原位PCR应该指以DNA为起始物，在原位对待定DNA序列进行扩增的聚合酶链反应。随着PCR技术的发展，出现了以mRNA为起始物，通过反转录合成靶序列的CDNA，然后以CDNA为模板施行聚合酶链式反应扩增，借以检测细胞内mRNA靶序列的原位反转录PCR。此项技术也被归人广义的原位PCR之列。原位再生式序列复制反应，是以mRNA为模板，通过逆转录酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶活性，以RNA／CDNA和双链CDNA为中间体，直接扩增RNA靶序列的一项技术。虽然再生式序列复制反应的扩增机理与聚合酶链反应不同，但两者亦有联系，具有一定的相关性，都属于特殊基因序列的扩增技术，故在此一并叙述。根据在扩增反应中所用的三磷酸核昔酸原料或引物是否标记，原位PCR可分为直接法和间接法两大类。 根据所用标记物的性质和扩增产物的检测方法不同，原位PCR又有许多不同的具体设计方案。本节中着重讨论直接法与间接法原位PCR，并简要介绍原位反转录PCR和原位再生式序列复制反应的特点。至于各种具体的设计方案及技术路线，可参阅有关文献。 3.2.1 直接法原位PCR 直接法原位PCR的特点是使扩增产物直接携带标记分子。在直接法原位PCR反应体系中使用标记的三磷酸核昔酸或引物。放射性同位素‘旧、生物素和地高辛精是三种最常用的标记物。当标本进行PCR扩增时，标记分子就掺入到扩增产物中。扩增产物的检测则根据标记物的性质设定，可用放射自显影术、免疫组织化学或亲合组织化学等方法（图3－l）。现已有不少用直接法成功地进行原位P