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透明质酸的研究进展 摘要： 透明质酸(yaluronic Acid简称HA)是一种国际上公认的生物大分子保湿剂用于眼科显微手术、关节炎治疗、高级化妆品等领域目前透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法.–D葡萄糖醛酸和β–D–N–乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成的高分子物质，是一种具有特殊功能的胞外酸性粘多糖，是构成皮肤真皮层的物质，广泛应用于脊椎动物的各种组织间质中。自20世纪30年代Mayer首次从动物眼玻璃体中提取得到HA后，HA的生产和应用研究至今已有70余年的历史。HA有独特的黏弹性和生理功能，是细胞外基质的主要成分，具有保水、润滑、调节渗透压等作用，可保护正常细胞免受毒性细胞、自由基等的侵袭，并可影响细胞增生、分化等。因此，HA广泛用于骨科、眼科、妇科、外科手术后防粘连、整形美容及保健食品等领域。近年的研究结果展示了HA有许多新的应用领域，并出现了新的衍生物，为开发HA的新用途奠定了基础。 １．目前HA的工业生产有两种方法:即提取法和发酵法。提取法主要利用鸡冠、人脐带、牛眼的玻璃体等为原料，进行生产，而且组织必须是新鲜采集，这样不但动物组织来源困难，且价格昂贵，成本高，这给HA的生产带来了一定的困难。发酵法生产HA，是利用链球菌将廉价的葡萄糖转化为HA，不依赖于动物器官，产量不受限制，成本也低，发酵液中的HA易于分离纯化，产品纯度高，但发酵法HA的产量不高。为此，我们对发酵法制备HA的工艺条件进行了实验研究，旨在提高HA产量，降低生产成本。 （１）．透明质酸的动物组织提取方法：以公鸡鸡冠为原料、以黄牛眼睛为原料和以人脐带为原料提取透明质酸。在此以公鸡鸡冠的提取工艺为例： 鸡冠→丙酮预处理→去离子水提取→氯仿、正丁醇除杂物→95%乙醇沉淀→氯仿、正丁醇分离→链酶蛋白酶处理→氯仿、正丁醇再除杂→十六烷基三甲基溴化铵（CATB）沉淀→0.8摩尔/升氯化钠溶解→95%乙醇沉淀→真空干燥箱中干燥 （２）．透明质酸的微生物发酵法： 主要仪器设备：研究用发酵罐、真空干燥、超净工作台、分光光度计、培养箱(温控)、摇床(微生物液体培养用)、灭菌锅、显微镜等。 菌株：试验用链球菌菌株、斜面培养基培养HA菌种。 培养基制备：蛋白胨10克、牛肉浸膏5克、酵母膏5克、葡萄糖5克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0．3克，加水溶解成1升溶液，115℃灭菌30分钟。 操作过程：从斜面培养基中取一环HA菌落装入有20毫升液体培养基(pH615)的指形瓶，放入摇床中，37℃，摇速设为150次／分。20小时后，接入200毫升液体培养基的三角瓶中，培养方法和上面相同，20小时后接14L的发酵罐中，培养基成分同摇瓶的一样，复合培养基+50毫升生产因子，以自来水代替蒸馏水，调pH6．5，高压蒸汽灭菌(15磅，121℃，50分钟)，接种量为10%，搅拌速度100次分，通气0．5vv／m，温度37℃，培养48小时。 　培养条件选择试验：分别从斜面培养基上取HA菌落装入到有100毫升培养基的摇瓶中，分别进行摇速、pH、培养温度、培养时间的选择试验，选出发酵菌的最佳培养条件。摇速选择设置220、200、180、160、150、120(次／分)6个摇速，pH为615，培养时间48小时，培养温度37℃;培养液pH选择，设置612、615、618、710 4个pH，摇速为150次／分，培养时间48小时，培养温度37℃;选择温度时，设置温度为28℃、32℃、37℃，摇速150次／分，pH 615，培养时间48小时;培养时间选择，设置36、48、72小时的3种不同培养时间，摇速为150次／分，pH为615，培养温度为37℃。在每个选择试验中，考察不同培养条件下的细胞干重和透明质酸(HA-yield)的得率。每个试验重复3次，取平均值。 　发酵罐生产试验：培养基成份同摇瓶的一样，罐内盛装１０升培养基，HA菌种接种量为10%。根据发酵菌培养条件选择试验结果，选用最佳的培养条件。pH用5M NaOH调节，并在发酵过程中应用自动流加保持发酵液的最佳pH。为了减少机械搅拌对HA分子的降解，对发酵罐的搅拌器及挡板进行了改装，选用低剪切力的搅拌浆，适当降低搅拌速度，以便监测发酵液溶氧。因此，试验选定100次分、150次／分两个摇速，并分别添加生产因子(微生物类，主要阻断HA的降解代谢，帮助HA积累)，不添加生产因子的作对照。 　　发酵菌培养条件选择试验结果：细胞干重和HA-yield的得率最高的摇速、pH值、培养温度、培养时间分别为150次／分、615、37℃、48小时。说明这是HA菌落的最佳培养条件。 发酵罐生产试验结果：摇速为100次／分时,添加生产因子能显著提高HA的产量。 　结论与讨论： 　　本研究在摇瓶阶段对培养条件进行选择。摇速为150次／分的HA产量最高,其次