【2017年整理】Hsp16.3蛋白纯化分析(中文).docVIP

暑期实验生化部分 一 实验目的 1．了解基本的分离提纯蛋白质的原理方法和技术。 2．提取分子和微生物实验中自制重组细菌产生的蛋白质HSP16.3。 3．测定HSP16.3的分子活性，了解其分子伴侣活性及寡聚结构。 4．提纯和检测Tag酶蛋白。 二 背景介绍 1．HSP16.3 HSP16.3是来自结核杆菌M.tuberculosis的小分子量热休克蛋白(430bp)。HSP16.3在正常条件下仅有少量表达，当M.tuberculosis从对数期到稳定期的转变中显著表达，并成为细胞内的主要蛋白。另外，HSP16.3还是M.tuberculosis很强的抗原性蛋白，是T，B细胞发生免疫反应的重要靶点。体外实验表明，HSP16.3具有分子伴侣的活性，HSP16.3在39.5℃时可以抑制柠檬酸合成酶的热聚集，且其活性不依赖于ATP，但不能保护柠檬酸合成酶的活性，说明HSP16.3是与部分去折叠的柠檬酸合成酶发生作用，体内蛋白的再折叠可能还需要其它蛋白参与。通过凝胶层析还可分离出HSP16.3与柠檬酸合成酶形成的复合物，并在随后的SDS中得到证实。HSP16.3可能是通过暴露疏水表面来行使其分子伴侣活性的。实验表明：HSP16.3在较温和温度和低浓度变性剂诱导下，如极低浓度的盐酸胍（0.05 M），尿素（0.3 M）或30℃的温度处理时，会暴露疏水表面使得其分子伴侣活力迅速上升。 HSP16.3是144个氨基酸组成的，分子量为16277Da ，其序列分析结果表明它属于?-crystalline相关的小分子量热休克蛋白（sHSP）家族的一员，具有?-crystalline蛋白家族典型的C末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A。小分子量热休克蛋白（small heat shock protein, sHSP）家族的蛋白具有多种不同的生物学功能，但都具有分子伴侣的活性，能与变性的蛋白质底物作用并不依赖于ATP参与。这一类蛋白的结构研究表明它们往往通过形成特定的寡聚结构来发挥功能，如M.Janneschii HSP16.5形成二十四聚体，小麦HSP16.9形成十二聚体。 HSP16.3是迄今为止发现的几种原核生物的sHSP之一，目前，对sHSP功能，作用机制了解还很少。 2．Tag酶 三 实验原理 1、超声波处理法破碎细菌 借助超声波的震动力破碎细胞壁和细胞器。处理的效果与样品浓度和使用频率有关。破碎微生物细菌和酵母菌时时间要稍长，使用时应注意降温防止过热。 Ni-NTA亲和层析（Ni-NTA Affinity Chromatography） （1）金属螯合亲和层析 金属螯合亲和层析介质上偶联的配基——亚氨基二乙酸钠（IDA），在偏碱的环境中容易于二价金属离子如Zn2＋，Cu2＋，Ni2＋发生可逆螯合吸附，二价金属离子又与流动相中的半胱氨酸、组氨酸、咪唑等物质发生可逆性的螯合吸附。金属离子在螯合介质与分离分子间起着桥梁的作用，金属离子一端与螯合介质连接，另一端与被分离组分结合。这两种结合方式都是可逆的，可以根据需要从不同结合部分解析下来。例如，以EDTA为洗脱剂可以从金属离子与螯合介质的结合部位洗脱下来，以咪唑为洗脱剂可以从金属离子与被分离分子的结合部位洗脱下来，利用这一特性可以分离不同用途的蛋白质。 （2）Ni－IDA和Ni－NTA IDA 只有三个金属螯合位点，与金属离子结合并不紧密，由此导致最后纯化产物不纯等问题。而Ni－NTA中，NTA是一个四配位基的螯合剂，可以与镍离子六个配位基中的四个螯合，镍离子剩下的两个配位基则与目标蛋白六个组氨酸残基（6x His tag）结合，在较高强度的洗脱条件下，仍保持良好的结合力。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 图1 不同的配基与镍离子的螯合 （左）Ni氨三乙酸配合物，NTA与镍离子中四个配位基结合，结合更紧密； （右）Ni亚氨二乙酸配合物，IDA与镍离子的三个配位基结合。 3、紫外吸收法测蛋白质含量 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 4. 透析（Dialysis） 经由半透膜的两端及透析液中的分子，经浓度的差异而互柤产生自由扩散(Diffusion)的现象叫作透析作用。 通常将半透膜制成袋状，将生物大分子溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边