【2017年整理】gentleMACS实验操作步骤中文.docVIP

gentleMACS? 操作步骤 1.背景信息 在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS?技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS? 分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。 2. 分离小鼠脾脏的操作步骤 2.1 需要的试剂和仪器 ● gentleMACS 分离器 ● gentleMACS C 管 (# 130-093-237) ● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407) ● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液) 2.2 步骤 ▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。 ▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄). 1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液: 1–2 个小鼠脾脏: 3 mL 3–4个小鼠脾脏: 6 mL 5–6 个小鼠脾脏: 9 mL 2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上 ▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域 3. 开机，选择合适的分离程序： 1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01. 3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04. 4. 运行 gentleMACS 程序 m_spleen_01. 或 m_spleen_04. 5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管 6. (可选) 以 300×g 室温下离心2分钟。 7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。或者将细胞悬液通过一个细胞过滤网（3-6个小鼠脾脏），该滤网放置于50mL试管中。 8.用5 mL 缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter） 9. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。 10.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。 3.用胶原酶分离小鼠脾脏的操作步骤 3.1需要的仪器和试剂 ● gentleMACS 分离器 ● gentleMACS C 管 (# 130-093-237) ● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407) ● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。 ● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2. ● 胶原酶D溶液：用HEPES液配置终浓度为100mg/mL的胶原酶D溶液。 ● DNase I溶液：准备终浓度为20000U/mL的DNase I溶液 3.2 步骤 ▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。 ▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄). 1. 将1-2个小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，在C管中加入4.9mL HEPES缓冲液，同时加入100uL胶原酶D溶液（终浓度为2mg/mL） 2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上 ▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域 3. 开机，选择合适的分离程序: m_spleen_02. 4. 运行 gentleMACS 程序 m_spleen_02. 5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管 6. 37°C孵育30分钟 7. 在C管中加入12.5-25uL的DNaseI溶液（终浓度为50-100U/mL） gentleMACS 分离器上 9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_spleen_03. 10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管 11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心。 12. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器，该预分选滤器放置于15mL管子中。 13.用5 mL HEPES缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter） 14. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。