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交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器 陈燕花 化工与资源环境学院 化学工程与工艺专业 指导教师：伍 林 1前言 随着生命科学的发展进入分子水平，有人预言21世纪将是检验医学的世纪，即从分子水平对疾病进行诊断和治疗。这就要求临床生物化学检验准确、快速、简便、标本微量化、方法标准化、且经济实用。生物传感器正是在此要求下出现的一类跨领域、多学科的前沿诊断仪器。 国内外对生物传感器展开了广泛深入地研究，已经研制出了葡萄糖生物传感器、乳糖生物传感器、尿酸酶生物传感器、DNA生物传感器、BOD生物传感器、测酚生物传感器等多种类别的生物传感器，来满足人们在临床检验、环境监测和生化分析[1-3]等领域中的需求。 本实验将纳米二氧化硅凝胶和尿酸酶紧贴于蛋膜上，将酶膜紧贴于普鲁士蓝（PB）修饰的玻碳电极表面，然后以自制铂片电极为对电极、甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，制成尿酸酶生物传感器。当体液中的尿酸通过酶膜时，与酶进行反应，检测出该处产生的反应电流，然后将其换算成尿酸浓度加以显示。应用尿酸酶传感器测定人体血和尿中尿酸的浓度，是一种准确、快速、简便的方法，可帮助诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病。 2 尿酸酶生物传感器的工作原理 尿酸酶生物传感器的工作原理是：尿酸在尿酸酶作用下，被分子氧氧化成尿囊素，并产生二氧化碳和过氧化氢。根据反应前后氧的消耗，我们用电极监测溶液中氧的变化，就可推算出尿酸的浓度，其工作机理[4]如图2： 图1尿酸在尿酸酶作用下的反应机理 Figure1 Principle of uric acid under the uricase 3 实验部分 3.1 仪器与试剂 试剂：尿酸酶（4.6units/mg， Sigma公司），牛血清白蛋白（BR），戊二醛（CP），磷酸氢二钠，磷酸二氢钾（AR），氯化钠(AR)，鸡蛋，气透膜，实验用水为二次蒸馏水。 仪器：玻碳电极（天津兰力天仪器有限公司），铂电极（自制，铂片长×宽×厚为5×4×0.25mm），甘汞电极（上海雷磁），CHI600型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。 3.2 尿酸酶电极的制备 取新鲜鸡蛋壳小心剥离蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸馏水清洗；称取12.5mg牛血清白蛋白（BSA）溶于250μL 10g?L-1尿酸酶溶液中；将蛋膜铺于洁净的玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜；在膜上依次滴加25μL尿酸酶-牛血清白蛋白混合溶液、改性纳米二氧化硅凝胶液、5μL 2%戊二醛溶液，室温放置3~4h，置4℃冰箱冷藏过夜；过夜后的蛋膜用磷酸缓冲液(PBS)漂洗数次；将酶膜紧贴于PB修饰的玻碳电极表面，覆盖气透膜，即制成尿酸酶电极[5,6]。 实验流程如图2所示。 图2 纳米颗粒增强的尿酸酶电极制作示意图 Figure2 Manufacture flow chart of nanoparticles strengthen uricase electrode 3.3 实验方法 采用三电极体系进行检测：饱和甘汞电极为参比电极，制作的尿酸酶电极为工作电极，自制铂片电极为对电极，底液为0.1mol ·L-1的KCl 磷酸盐缓冲溶液，在一定的温度下进行检测。测量时，先将三电极置于缓冲溶液中，加一电压于工作电极(0.4ＶvsSCE)，当背景电流值减小至一恒定值时，将电极放至被测尿酸溶液中，分别记录不同时间的电流响应值，扣除初始背景电流值，即为被测尿酸离子浓度的电极电流响应值。 4 影响因素分析 4.1 尿酸浓度的影响 测量不同浓度尿酸的响应信号，使得电极响应与尿酸浓度成很好的线性关系，酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安如图3所示。确定尿酸酶生物传感器检测尿酸浓度的线性响应范围，如图4 所示。实验测定尿酸浓度的线性响应范围为7.5×10-6~1.5×10-4mol·L-1。 图3酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安图 图4尿酸浓度与响应电流线性关系图 Fig3 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor Fig4 Linear relationship’ chart of difference of urate standard in different concentration of uric acid current response solutions on the urate biosensor (a.112.5μg/mL, b.75μg/mL, c.37.5μg/mL, d.7.5μg/mL, e.0μg/mL) 4.2 尿酸酶浓度的影响 向尿酸溶液中多次加入尿酸酶，以测定不同浓度尿酸酶对