实验1植物组织中几种重要碳水化合物..docVIP

实验1 植物组织中几种重要碳水化合物 的分组分离及其测定 一、植物组织中几种重要碳水化合物的分组分离 植物体内的碳水化合物按照化学性质，可分为单糖、寡糖和多糖三大类，每一类中又可分为若干种，其生理作用各不相同。测定时按照测定目的不同可分类提取，分别测定。常用的分离提取方法是根据各种碳水化合物在乙醇和水中的溶解度不同，以及水解的难易加以区别。这种方法在一般的营养状况研究中经常采用。当需要对每一种糖进行分离鉴定时，则必须利用更加精密的分离方法，如纸层析分离法或直接在纸谱上显色，利用光密度计鉴定。现代的高效液相色谱分析更是进行碳水化合物分离鉴定的有效手段。本实验只介绍常规的分离方法。 原理 碳水化合物中的单糖及寡糖易溶于水及乙醇，而糊精、果聚糖等多糖可溶于水但不溶于乙醇；淀粉不溶于冷水，但经加热糊化后亦可部分溶于水中，半纤维素不溶于热水，但可用稀酸水解，纤维素则只可用浓硫酸方可水解，故可用不同方法提取植物样品以测定不同类型的碳水化合物。可溶性糖（单糖、寡糖）一般用82%乙醇提取，其残渣经40℃～50℃热水提取，可测定其中的糊精、果聚糖（葡糖）等水溶性多糖。剩余部分有淀粉、半纤维及纤维素，其中淀粉可用淀粉酶水解，也可用过氯酸提取，残渣用2%的盐酸加热水解，以测定半纤维素，而纤维素则用80%的浓硫酸溶解，分别测定各级提取液及水解液，即可求出各种类型碳水化合物的含量。 方法 （一）样品的预处理 测定碳水化合物的含量可用新鲜样品或烘干样品。其原则是，从取样至样品完全杀死以前，尽量减少植物体内碳水化合物的含量及种类的变化。当用于样品分析时，应迅速将样品放在105℃烘箱中20分钟左右，将细胞杀死，然后在80℃下烘干。幼嫩材料含单糖多的，烘干温度过高糖易焦化，最好在60℃下，用真空干燥箱烘干。样品烘干后，用粉碎机粉碎，全部通过60目筛，即可作为分析样品。 如用鲜样品直接分析，应取剪碎的新鲜材料二份，准确称重，一份放入105℃烘箱中，烘至恒重，测其含水量，以求得供试材料的干重，另一份立即投入几乎沸腾的95%乙醇中，以停止酶的活动，乙醇的用量应使加入植物材料后，其浓度不低于80%，如此固定的材料也可长期保存。 （二）碳水化合物的系统分离 较细致的分离方法可将碳水化合物分为以下五组： 1．可溶性糖类（包括单糖、寡糖），可按下列步骤进行： （1）浸提：精确称取干样品二份，第一份重5克，于105℃下烘至恒重，测定含水量。另一份重1克，供分析用。 将样品投入100ml三角瓶或大试管中，加82%的中性乙醇20-30ml（乙醇用量依材料中含糖量而定，含糖量高的应适当多加），瓶口塞以带长玻管的塞子，作回流冷凝用。将三角瓶固定在支架上，在70～75℃恒温水浴中抽提30分钟，如材料含酸过多，应加少量饱和Na2CO3溶液中和，以防提取过程中蔗糖的水解。浸提完毕，待澄清后，将上清液过滤入蒸馏瓶中（过滤时尽量避免将残渣倾倒在滤纸上），另换乙醇浸提，反复3-4次（后几次浸提时间可减至10～15分钟），最后把全部乙醇提取液连同残渣过滤入蒸馏瓶中（如为新鲜材料，应将固定时所用乙醇一并倾入蒸馏瓶中），用少量乙醇冲洗容器及漏斗中残渣，不使糖分有损失。残渣保留，供分析第二组碳水化合物用。 （2）蒸去乙醇：将上述乙醇提取液在40～45℃水浴上进行减压蒸馏，当浓缩成浆状物以后，再加蒸馏水10ml，继续蒸馏，以去尽残留的乙醇，最后再在粘浆状物中加少量温暖的蒸馏水，以溶出可溶性糖，转入另一锥形瓶中，用少量蒸馏水洗涤蒸馏瓶，洗后的水也倒入同一锥形瓶中，使总体积不超过40ml，蒸馏瓶壁上若有不溶物，可不必管它。 亦可将提取液洗入蒸发皿中，放在40～45℃水浴上蒸发，至乙醇完全蒸发为止，冷却后，用水约20ml溶出可溶性糖，无损地转入锥形瓶中。 （3）沉淀蛋白质：向浸提液中滴入10%中性醋酸铅，以沉淀蛋白质，直至不再产生沉淀为止。再滴入10%硫酸钠或草酸钠溶液以除去多余的铅，以免妨碍以后的分析，直至不再产生沉淀为止。过滤入50ml容量瓶中，用少量蒸馏水冲洗容器及残渣数次，洗涤液一并加入容量瓶中，最后加水定容，即可供测定用。有些提取液中蛋白质等杂质少，沉淀蛋白质一步可省去，提取液立即测定，以免微生物滋生，如须保存一定时间，应放入冰箱中，或加1～2滴氯仿防腐。 （4）还原糖的测定：把提取液配制成适当浓度（如提取液浓度过高，应按一定倍数稀释后测定，记下稀释倍数），然后测定还原糖浓度A（mg/ml），再以下式求出组织中的还原糖（包括单糖及1/2麦芽糖）： 还原糖（%）=[(还原糖浓度A×提取液总量×稀释倍数)/组织干重]×100 （5）蔗糖的测定：吸取提取液4ml加入大试管中，加入10%HCl 1ml，使溶液中HCl浓度为2%，若溶液含糖量高，可适当减少提取液用量，同时适当