第14章基因工程课件.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第 一 节 重组DNA技术 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) * 目 录 * 目 录 第 十 四 章 目 录 DNA Recombination Technique 一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 （一） DNA克隆 技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　 DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 重组DNA技术中常用的工具酶 切除末端磷酸基 碱性磷酸酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 末端转移酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 多聚核苷酸激酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 反转录酶 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 Klenow片段 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 DNA聚合酶Ⅰ 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA连接酶 识别特异序列，切割DNA 限制性核酸内切酶 功 能 工 具 酶 （二） 限制性核酸内切酶 定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG （三）、目的基因 目的基因：对基因组中某个基因进行研究或应用称这种基因为目的基因*（又称目的DNA，外源DNA）。 类型： cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) （三）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。即 供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 载体的选择标准 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 质粒 (plasmid):存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA。 特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病