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聚合酶链式反应 （PCR） PCR的定义 PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。 PCR的成分和作用：终浓度 1. 缓冲液 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。 2. MgCl2 1.5 ～ 2.0 mM Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 3. dNTPs dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.02 ～ 0.2 mM dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 4. 引物 (Primer-P) 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.2 ～ 1 μM 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl 偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低 6. 模板DNA (Template) 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低 7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。 PCR反应体系 本次实验 50μl 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。 master mix: 25μl 引物 ： 2.0μl 模板： 1μl 水： 22μl * * 生物化学与分子生物学教研室 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 反应条件 预变性 94℃ 3min 变性 94℃ 30s 退火 55℃ 30s 延伸 72℃ 30 s 72℃ 5 min 12 ℃ 保存 30个循环 PCR体系 master mix 10×buffer MgCl2 dNTPs Taq 酶
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