实验三 光合作用的希尔反应课件.pptVIP

实验三 光合作用的希尔反应 【实验原理】 离体叶绿体加到具有适当氢受体（A）溶液中，光照后放出氧气。 2H2O +2A 2AH2+O2 实验中用的氧化剂A是2,6－二氯靛酚（2,6-D），是一种蓝色染料，接受电子和H+后被还原成无色。在光下，叶绿体将2,6-D还原，从蓝色到无色。通过测定其光密度的变化，可以得出叶绿体的还原能力。 DCMU (二氯苯基二甲基脲，dichlorophenyl dimethylures,商品名为敌草隆，diuron)等除草剂是作用于光合作用光系统II中质体醌QB结合部位 。它们竞争性地替换与DI蛋白结合着的质体醌QB，导致电子传递受阻，抑制Hill反应的发生。 非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被DCMU所抑制，而环式光合磷酸化则不被DCMU抑制。 【实验材料】 菠菜叶片 【实验器材与试剂】 实验器材：⑴研钵; ⑵移液管; ⑶离心机; ⑷722型分光光度汁; ⑸500瓦灯泡 实验试剂：(1) 提取液(0.02M Tris-HCl 缓冲液，含有0.4M蔗糖，0.03M KCl，pH7.5)；(2) DCMu(用0.02M Tris-HCI缓冲液配制成5μM DCMU溶液)；(3) 2,6-D,即2,6-二氯靛酚(用0.02M Tris-HCI缓冲液配制成0.003％ 2,6-D溶液)；(4)80％丙酮；(5)0.4M蔗糖等 【实验步骤】 叶绿体的提取 ① 将4g新鲜叶片去叶脉后剪碎，放于预冷的研钵，加入4mL预冷的提取液，研磨成匀浆，再加4mL预冷的提取液混匀，将所有的匀浆液用4层纱布过滤，弃去杂质。 ② 收集过滤液于离心管中，4℃1000rpm离心 3min，收集上清液于一新的离心管，弃去沉淀。 ③ 4℃ 3000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀悬浮于冷的4mL提取液，即为叶绿体提取液。 叶绿素含量的测定 取0.1ml叶绿体悬浮液于7ml离心管，用4.9ml 80％丙酮稀释到5ml，混匀后，在652nm下测定吸光度，来计算叶绿素含量。 C(mg/mL)= OD652×1/34.5×稀释倍数 用预先冷冻的提取液稀释叶绿体悬浮液，总体积8mL，使叶绿体悬浮液浓度约相当于叶绿素浓度为0.04mg/mL。 Hill反应 取9支试管，包好黑纸并编号1-9，按下表所列试剂分别加入9支试管中。 提取缓冲液做参比，600nm读取1号管光密度，分别取0.5mL和1mL叶绿体悬浮液放入2号和3号试管中，立即于600nm读取光密度，再按表中要求加入叶绿体悬浮液于其它试管中，然后把黑纸剥掉, 将4号、6号和8号管放在距光源20cm处，把5号、7号和9号管放在距光源60cm处（注意：试管放在盛有水的烧杯中），10分钟后，立即用黑纸把试管包好放冰浴中，然后于600nm分别读取光密度。 【注意事项】 叶绿体提取： 在冰浴低温条件下操作， 上清液和沉淀的保留与否。 希尔反应: 每管反应的总体积相同，且做好标记； 在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测定叶绿体含量时用丙酮稀释不同； 光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上（冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）。 【思考与作业】 解释叶绿体浓度和光照强度对希尔反应有何影响？ DCMU抑制希尔反应活性的机理何在？ 为得到理想的实验结果，在实验中应注意的主要问题何在？ * * 植物生物学实验-植物生理部分 光 叶绿体 Cl 2 OH Cl Cl NH OH Cl N OH O ＋ 2H2O 2 ＋ O2 光 叶绿体 氧化型二氯靛氛 （蓝色） 还原型二氯靛氛 （无色） 1.0 3.0 1.0 -- 8和9 1.0 -- 1.0 3.0 6和7 1.0 -- 0.5 3.5 4和5 -- -- 1.0 4.0 3 -- -- 0.5 4.5 2 1.0 -- -- 4.0 1 2.6-D/mL DCMu/mL 叶绿体/mL 提取液/mL 试管号