实验——DNA分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接课件.pptVIP

DNA分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接 实验原理 限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类能识别双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶，简称限制酶或内切酶。 EcoR I 酶识别： 5′N-G↓A-A-T-T-C-N- -N-C-T-T-A-A↑G-N-5′ Bam H I 酶识别： 5′N-G↓G-A-T-C-C-N- -N-C-C-T-A-G↑G-N-5′ 实验原理 限制性核酸内切酶的命名：以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系）。 EcoR：来自Escherichia coli RY13 BamH：来自Bacillus amylolique faciens H（淀粉液化芽孢杆菌） 在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号。 实验原理 两种不同的限制性核酸内切酶同时切割同一底物时，要采用两种酶都适合的缓冲液。 本实验所用的10 ?K缓冲液，成分如下： 200 mM Tris-HCl，pH8.5 100 mM MgCl2 10 mM DTT（二硫苏糖醇） 1000 mM KCl 实验原理 操作步骤 双酶切反应： 在离心管内，按顺序加入下列成分（单位：?L）： ?底物DNA 24 10?K缓冲液 3 EcoR I酶 1.5 BamH I酶 1.5 总体积 30 把离心管放入37℃水浴中酶切2小时后，85℃水浴5 min终止酶切反应。 操作步骤 酶切产物的纯化： 往反应体系中各加入60?L的0℃无水乙醇，混合后冰浴2分钟。12000 rpm离心5 min。 用200?L 70%乙醇洗涤双链DNA沉淀， 12000 rpm离心2 min。去掉上清，用热风吹干。 以10 ?l无菌双蒸水溶解沉淀。 连接反应：在PCR管内，按照顺序加入下列成分（单位：?L）： pUC19双酶切产物 1.5 PCR产物双酶切产物 6.5 10?T4缓冲液 1 T4连接酶 1 总体积 10 注意事项 每吸取一个试剂，都要更换枪头，防止溶液的污染。 加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回冰浴。 往反应体系中加入新的试剂时，把枪头伸入液面以下，反复吹吸以使溶液混合。 纯化DNA片段时，小心倾倒上清液，不要把DNA倒掉。 若反应体系管壁上挂液，必须高速离心使反应液集中。 思考题 限制性内切酶切割实验中，酶切的时间过长或过短有对酶切效果有何影响？ 影响连接酶作用效果的因素主要有哪些？ 下次实验 重组DNA转化宿主细胞 * * * * * * * * * * * * * * * * * *