XY09 04细胞破碎课件.ppt

知识点： 细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备。 难点：常用破碎方法的合理选用。 概 述 一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固-液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。 但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。 概 述 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身：单细胞蛋白（SCP） 胞内产品：碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等 什么是细胞破碎技术？ 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 第一节细胞的结构和破碎阻力 1、细胞的结构 细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。 真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。 2、破碎阻力分析 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的 （1）细菌肽聚糖结构示意图 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。 革兰氏阴性菌与阳性菌差别 虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但是革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有20~80nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的40～90％，此外细胞壁还含有大量磷壁酸(eichoic acid)。而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细胞壁成分的10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。 小结 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 破碎酵母细胞壁的阻力 酵母细胞壁的结构示意图如图所示，细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 4、红面包霉菌(Neurospora crassa)的细胞壁结构示意图 主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 5、植物细胞壁的