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College of Enology, NWSUAFEthyl carbamate precursor citrulline formation from argininedegradation by malolactic wine lactic acid bacteria 汇报人：王利廷 学号：2015051500 2016.06. 摘要：测定了葡萄酒苹果酸乳酸发酵所用的主要商业菌株于葡萄酒pH条件下，在静止细胞中的精氨酸代谢，旨在评价这些菌株分泌和利用瓜氨酸的能力，瓜氨酸是氨基甲酸乙酯的前体物，所有的菌株都测定了精氨酸分解过程中瓜氨酸的分泌，瓜氨酸是菌株在富含精氨酸的培养基生长过程中产生的细胞分泌物并随着细胞的溶解释放出来。所有的菌株被发现能降解作为唯一氨基酸的瓜氨酸，并且某些菌株能再利用先前释放的瓜氨酸。关键词：精氨酸分解、瓜氨酸、氨基甲酸乙酯、乳酸菌、苹果酸乳酸发酵、酒球菌苹果酸乳酸发酵（MLF）葡萄酒中乳酸菌LAB 脱去苹果酸的羧基产生乳酸的微生物过程，MLF可以由葡萄酒中天然存在的乳酸菌自发产生，也可由接种一个或多个LAB 来诱导产生，后者在红葡萄酒和白葡萄酒中已广泛应用，尤其是在酿酒冷凉地区。MLF最主要的作用就是通过将二羧酸（L型苹果酸）转变成一羧酸（L-乳酸）来达到降酸的作用，并且还可以修饰香气成分。LAB在酒中的代谢活动能引起氨基甲酸乙酯EC前体的产生，EC，也称尿烷，是在大部分发酵食品中存在的多能致癌物。通过精氨酸脱亚氨酶途径（ADI）瓜氨酸作为LAB分解精氨酸的中间产物，被认为是EC的前体物，酒中LAB的大部分菌株能分解精氨酸。材料与方法 微生物 ：酒中的LAB来自于the Wine Microbiology Laboratory Culture Collection of the Institute of Molecular BioSciences, Massey University, Palmerston North, New Zealand，所有的菌株都是异性发酵。材料与方法培养条件和resting cell experiments（rces）：（1）细胞在500 ml 的TJAG液体培养基中生长（含5g/L的L-精氨酸来诱导ADI途径中的酶），延滞期/平稳早期阶段处于30℃，通过沉淀物来评估，15℃条件下5000*g离心分离10分钟获得细胞。（2）用buffer 水（7.5 g 酒石酸和5 ml 的矿物质溶液，用NaOH调整pH到3.6，矿物质溶液，矿物质溶液包括1 L去离子水：200 g Mg2SO4.7H2O，50 g MnSO2.4 H2O）冲洗两次。材料与方法（3）然后用合适的rces缓冲液（5-25 ml;）重新悬浮细胞，将细胞吸取到小玻璃瓶中，小玻璃瓶中装有D型果糖（50% w/v）和L型精氨酸（10% w/v），精氨酸和瓜氨酸的最初浓度为400-1000 mg 。果糖的初始浓度与精氨酸或蛋氨酸的初始浓度相当。（4）细胞干重2-10g，放到玻璃容器中，25℃水浴，慢慢搅拌，定期取样，离心（10000*g，5分钟），悬浮液冷冻于-18℃，以待进一步分析。分析吸取1.5ml的细胞培养液于称重好的1.7 ml 的微型离心管中，以确定rces中细胞的干重，经过离心（10000*g，10分钟）后分离上清液，反应管100℃干燥过夜，把同样的空管按相同方法操作所得到的重量差作为管的失水量。精氨酸的浓度通过Staron-Allard方法得到的色度来确定。瓜氨酸的浓度用Spector 修订的Archibald方法得到的色度来确定。结果在同一悬浮液中，瓜氨酸的分解速率明显低于精氨酸。所有菌株都能分解精氨酸，分解速率因菌株而异，并且很明显与生物量浓度相关，所有的菌株也都分析了分解精氨酸过程中瓜氨酸的分泌速率，分泌速率也因菌株而异。Fig. 1.静止细胞布氏乳杆菌CUC-3在pH3.6条件下对精氨酸和蛋氨酸的分解，这两个实验在一个细胞悬浮液的小样中进行，精氨酸分解：精氨酸（--，-）瓜氨酸（- -）瓜氨酸分解：瓜氨酸（- -）。结果消耗完精氨酸以后才能分解瓜氨酸，瓜氨酸有二次增加，因此我们研究了精氨酸消耗之后瓜氨酸的来源，在rces中，不添加精氨酸，瓜氨酸和果糖。Fig. 2. 酒球菌LO-111静止细胞在pH3.6条件下精氨酸的分解和瓜氨酸的分泌，精氨酸（- -），瓜氨酸（- -）。结果Fig.3在没有添加精氨酸，瓜氨酸，果糖情况下，静止细胞酒球菌Lo-111在酒石酸缓冲液（pH3.6)培养24h后瓜氨酸的释放，X轴代表前准备添加到液体培养基中精氨酸的量，两次实验得到平均值。 结果Fig. 4.布氏乳杆菌CUC-3在没有添加精氨酸，瓜氨酸，果糖条件下在酒石酸缓冲液（pH 3.6） 中瓜氨酸