第一部分核酸的制备(分离、纯化)课件.pptVIP

第一部分 核酸的制备（分离、纯化） 核酸的制备（分离、纯化） 一、总论 二、以质粒DNA为例谈DNA的分离纯化 三、以真核生物为代表介绍总RNA的纯化 四、核酸的进一步纯化（聚乙二醇、氯化铯梯度离心 问题： 分离核酸的基本依据、方法？ 核酸分离主要需要注意的是什么？ DNA和RNA分离时的主要差别？ 不同的生物体中，核酸所处的环境不尽相同：1、核酸与蛋白质结合紧密程度不同。2、DNA与RNA含量有差别。3、核酸分子量大小有差别。4、….. 由于核酸性质基本相同，生物体所组成的成分基本相同，因此，对于不同的生物体核酸的分离方法相差不大。 以上是常见核苷酸结构，中性PH下的离子状态的钠盐形式。 结构决定性质，性质是分离的基础。 核酸的结构特点： 分子巨大，有共扼双键、氢键、苷键、和磷酸二酯键，自由氨基、磷酸基。 核酸的二级结构：DNA双螺旋结构；RNA大多为单链，链的许多区域或自身发生回折，回折区内的多核苷酸段呈螺旋结构。 核酸性质—核酸性质与其结构和组分是密切相关的 分子量大小：RNA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106 或者更大。DNA分子量1.6×106-2.2 × 109 。 性状和溶解度：DNA多为白色纤维状固体。RNA为白色粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有机溶剂（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。 吸收光谱：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独特的紫外吸收光谱。核酸在240-260nm的紫外波段有强烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通过OD260/OD280 的比值可判断样品的纯度。纯DNA的OD260/OD280 =1.8，纯RNA的OD260/OD280 =2.0。核酸中若含杂蛋白或苯酚则比值明显降低。 对于纯核酸样品只要读出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260 =50ug/ml（双螺旋DNA）、 1OD260 =40ug/ml（单螺旋DNA或RNA）、 1OD260 =20ug/ml（寡核苷酸）。 变性：加热、强酸碱或射线及一切可破坏核酸分子氢键的处理。变性后的核酸理化性质、生物功能都会有显著变化，最重要表现为粘度下降。 降解：酸、碱、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。 分离核酸共同要考虑的 防止核酸变性与降解：①低温操作。②分离过程需加入必要的核酸解聚酶的抑制剂（如： 乙二胺四乙酸（EDTA）、柠檬酸盐、皂土、8-羟基喹啉、SDS、苯酚等） 脱蛋白：在生物体内核酸常与蛋白质结合以核蛋白形式存在 ，核酸所处的任何生物环境都含有蛋白质，所以在核酸纯化过程中需使用脱蛋白剂。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白质降解或变性，达到与核酸分离的目的。 DNA和RNA的分离：1、利用DNA和RNA在不同盐浓度下，溶解度不同进行分离（DNA在1-2M时溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低盐浓度0.14M时溶解度大，DNA小。）2、通过使用DNA或RNA酶，达到DNA和RNA分离的目的。3、根据分子量不同，进行梯度离心，进行分离。 核酸的收集： 多用乙醇、异丙醇 质粒DNA纯化 细菌培养 从LB琼脂扳上挑取一个单菌落。 接种到含有适当抗生素的20ml液体LB中。 37℃摇床培养过夜（OD ＝0.6）。 将上述培养液转入500ml含抗生素的液体LB培养基中。 37℃ 300rpm 约3～4hr（OD =0.4）。 加入2.5ml 氯霉素（34mg/ml溶于乙醇） ，使终浓度为170ug/ml。 300rpm 37℃ 继续培养 12～16hr。 离心 4℃ 4000rpm 15min。 弃上清。 将细菌沉淀重悬于100ml预冷的STE中。 离心 4℃ 4000rpm 15min。 弃上清，收集细菌细胞。 LB培养基 Trypone 10g Yeast extract 5g NaCl 10g 加水至1L STE： 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.CL（PH8） 1mmol/L EDTA（PH8） 1、酚提取法： 将收获的细胞重悬在20ml含20％蔗糖的TES中。 加入新鲜配制的溶菌酶到终浓度为1mg/ml（枯草杆菌和大肠杆菌）或5mg/ml（苏芸金杆菌）。 37℃保温30—90分钟，原生质游离出来。 向原生质溶液中加8％SDS20ml和5M NaCl 10ml。 68℃保温5min。 将溶液储于4℃冰箱，8hr以上或过夜。 取出后，立即在4℃离心18000rpm, 30min。 取上清。 向上清中加入等体积的重蒸酚（PH6—7），轻摇。 置冰箱15min，离心取水相。 重复一次。 再用等体积的氯仿—异戊