实验八粗糙链孢菌的顺序四分子分析.pptVIP

遗传学实验 实验八 链孢霉四分子分析 （３学时） 一、教学基本要求 1、 了解粗糙链孢菌的生活周期及特性。 2、 学习顺序四分子的遗传学分析方法 二、教学内容 〖目的和要求〗 要求学生加深了解顺序四分子分析的原理和方法，增加链孢霉杂交的感性认识，并能进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。从而正确认识和验证分离和交换定律，并了解基因转变现象。 〖实验目的〗 通过对粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表现型的分析，了解顺序排列的四分体的遗传学分析方法，进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。 〖实验材料〗 1．粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+,接合型 α。 2．粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a 。 〖实验器具和药品〗 1．器具：显微镜，钟表镊，解剖针，接种针，载玻片，试管，培养皿。 2．培养基 3．药品：5%次氯酸钠（NaClO），5%石碳酸。 〖实验步骤〗 1．菌种活化：为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化。把野生型和赖氨酸缺陷型菌种从冰箱中取出，分别接在两支完全培养基试斜面上，28℃温箱培养5天左右。培养到菌丝的上部有分生孢子产生。 2．杂交：接种亲本菌株，可采用下述方法。 〖实验结果〗 1．观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算Lys基因的着丝粒距离。 2．绘一显微镜下观察到的杂交子囊的图。 3．说明粗糙链孢霉中基因分离现象和高等动物、高等植物中基因分离的主要区别。 4．用图表示第六种子囊类型的形成。 5．实验结果说明 结果说明 1.赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟而呈黑色时，赖氨酸缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。但是如果观察时间选择不当，就不能看到好的结果。过早，所有的子囊孢子都未成熟，全为灰色；过迟，赖氨酸缺陷型的子囊孢子也成熟了，全为黑色，就不能分清各种子囊类型。所以在子囊果形成期间，要预先观察子囊孢子的成熟情况，选择适当时间进行显微镜观察。 结果说明 （续） 2.有时观察到的子囊孢子的排列为++++++--，++------，+++++---，---+++++，即为6∶2或2∶6的分离比和5∶3或3∶5的分离比。排除上面第（1）点说明的原因外，这样的情况的出现是由于基因转变造成的。基因转变的频率因基因位点不同而异，但一般在1%左右。 3.本实验用的赖氨酸缺陷型菌株为Lys5，Lys5基因座位于第六连锁群，着丝粒距离约为14.8图距单位。可供实验结果计算时参考。 * * 实验原理 链孢霉的生活周期 （1）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25℃温箱进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后5-7天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果，在7-14天左右，就可在显微镜下观察。 （2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5-7天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5毫升），继续在25℃培养。原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即成熟。 3．显微镜观察： （1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。 （2）取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（10×15倍）检查，即可见到30-40个子囊。观察子囊中子囊孢子的排列情况。这里用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，用盖玻片压，盖玻片会破碎。也可在显微镜下用镊子把子囊果轻轻夹破，挤出子囊。如发现30-40个子囊象一串香蔗一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入50%的石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。 4．实验步骤说明 （1）实验所用的赖氨酸缺陷型，有时接种在完全培养基上，也长不好，需要加适量赖氨酸。 （2）杂交后培养温度要控制在25℃；30℃以上即抑制原子囊果的形成。