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细胞工程实验动物细胞培养部分 实验二 动物细胞原代培养 细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。  细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。 一、实验目的  1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程； 2. 学习动物细胞原代培养基本方法，初步掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态特点。 实验原理  将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。 二、实验用品 1、仪器与用品：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、灭菌高压锅、离心机、水浴箱、培养瓶或培养板、吸管、移液管、培养瓶、青霉素瓶、平皿、手术器械。 2、材料：胎鼠或新生鼠。 3、试剂：DMEM培养基、小牛血清、0.25%胰酶一0.02％EDTA、PBS、75%酒精。 三、操作步骤  （一）胰酶消化法? 1、取材 （根据实验动物任选） （1）用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。 （2）将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精浸泡数秒钟消毒（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内），带入超净台内取胎鼠（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置无菌平皿中。 2、切割 ：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 3、消化：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液2ml，加入离心管中，与组织块混匀后，旋紧盖子，置于37℃水浴中消化10分钟，每隔几分钟摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。 三、操作步骤  4、加入5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂），1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 5、接种培养： 向离心管中加入5～10ml含10％小牛血清的DMEM培养基，用吸管吹打混匀，移入6孔细胞培养板中，置于二氧化碳培养箱中培养。 6、结果 ： 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。?? 上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。 三、操作步骤  （二）组织块直接培养法 自上方法第2步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 四、注意事项  1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免增加污染机会或溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 五、无菌操作的几个注意事项  1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。 2、点燃酒精灯，随后的整个无菌操作过程都要在火焰附近进行。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。 4、培养瓶、试剂瓶等要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。 5、使用的吸管在从消毒的铝盒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。 6、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防