免疫沉淀类试验——双扩、免疫比浊1试卷.pptVIP

沉淀反应 微生物与免疫教研室 沉淀反应（precipitation） 是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 分类 沉淀反应的特点 抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖 沉淀反应分两个阶段： 第一阶段、抗原抗体特异性结合 第二阶段、形成可见的免疫复合物 免疫浊度测定 经典的沉淀试验有4个缺点无法克服： 操作繁琐 敏感度低（10～100μg/ml） 时间长 难以自动化 （一）免疫浊度分析的基本原理： 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(19S)，在增浊剂(如PEG、NaF等)的作用下，迅速形成免疫复合物微粒(19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量 （二）类型 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 免疫胶乳比浊法 1 透射免疫比浊法 原理： 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。 方法评价： 优点： ① 灵敏度比单扩法高5—10倍； ② CV小于10％； ③ 操作简便快速，1h可报告结果； ④ 结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。 2 散射免疫比浊法 原理： 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比浊法(endpoint nephelometry)。 3 免疫胶乳比浊法 原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。 方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。 总评价 优点： ①自动化 ②快速(30～60s) ③灵敏(μg/L) ④准确 ⑤精密度高(CV5％) ⑥稳定性好 ⑦节省试剂 ⑧检测范围广 ⑨不需减去样本和试剂本底值等优点。 (三)、主要影响因素 抗原抗体比例 抗体的质量 抗原抗体反应的溶液 增浊剂的使用 1 抗原抗体比例 高剂量钩状效应（high dose hook effect ) 海德堡（heidelberger）曲线理论 2 抗体的质量 （1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源 3 抗原抗体反应的溶液 pH 6.5~8.5 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液） 4 增浊剂的使用 PEG、tween-20等非离子型亲水剂 作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation) 主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 一、单向免疫扩散试验 (一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 (二) 操作步骤（平板法） 1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻倾注成平板。 2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。 (三) 方法评价 单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L (四) 影响因素 1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血