标准的-定量Q-PCR仪器的具体使用步骤和操作方法.docxVIP

Q-PCR仪器使用具体步骤首先将Mx3000P电源打开，大约1min，将会听到启动的声音。然后打开桌面上的“Mx3000P软件”，确定软件界面右下面的联机标志呈绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示Instrument to PC communications have failed ,这时只需稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机；在“Mx3000P软件”的“New Experiment type”弹出框中选择需要的实验类型：通常选择“SYBR? Green(with dissociation curve),点击“OK键”；确定“Mx3000P软件”界面上面（Selection命令下）的卤钨灯已经打开。绿色说明已经打开，黄色说明正在预热，红色说明没有打开；最好在仪器与光源预热20min后开始实验；在“Plate Setup”里，对96孔板的各空进行设定。设定Standard(标准品)、NTC（阴性对照）、Unknown(样品)等，并选择正确的通道（FAM,HEX,ROX,Cy5）.对于标准品，设定其模板浓度，还需要对不同的样品进行编号。或者点击“Import”,导入以前使用的96孔板设定。具体为：首先选择Welltype中的Unknown，然后选择下方的ROX、SYBR;选择Reference dye的ROX用Replicate symbol对每个样品进行标记（1,2,3，XXX等）切换至“Thermol profile setup”界面,进行PCR循环的设定。可以改变各项温度、时间、循环数等，或者删除、添加特定步骤和循环。或者点击“Import”， 导入以前设定的PCR程序。表示 表示在这一步结束时采集荧光信号， 代表在这一步的全过程中都采集荧光信号，一般用作溶解曲线分析。ENDALL“ Thermol profile setup ”设定结束后，点击软件界面右上方的“Run”,软件界面右下方会出现运行状态显示框“Run Status”, 可以选择“Turn lamp off at end of run”,点击“start”开始实验，弹出“保存文件的对话框”，选择后保存，弹出另外一个对话框，选择第二个（预热之后跑），另外在运行过程中可通过点击“Add cycles”来增加扩增的循环数，在PCR运行结束后软件将自动关闭卤钨灯。ENDALL在PCR运行的过程中可以点击“Raw Data plots”,观察样品的实时扩增原始结果。∑ PCR运行结束后，点击“Analysis”,在点击“Results”,软件将会自动进行结果分析，也可以点击∑ 手动进行结果分析。结果分析：将Q-PCR结果从电脑中拷出来，在电脑上打开文件；点击菜单栏的“File”命令，选择“Convert to New Experiment type”子命令，弹出“Selection new Experiment type”对话框；在“Selection new Experiment type”对话框中选择“Comparative Quantitation(Calibrator)命令，将文件转化成分析结果的模式，点击OK键；弹出“Mx3000P软件”界面，在“Plate Setup”界面中“首先选择Welltype中的Unknown，然后选择下方的ROX、SYBR;选择Reference dye的ROX将96孔板中的Actin样品选中，然后在Nomalizing assay 中选择SYBR；然后对相同模板的样品标记相同的字母，对相同引物的样品标记相同的数字；最后任意（通常选最左侧的）选择一列，在Well type中选择“Calibrator”,然后可以进行所含特异引物的样品的选择，选择后，点击“Analysis”命令，在点击“Results”即可对结果进行可视化的各项分析。