酵母双杂交自激活课件.pptVIP

酵母双杂交 自激活 真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域 domain 组成的。 一、原理 酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域 DNA binding domain,BD ，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域 transcription activation domain,AD 。 GAL4分子的BD可以同上游激活序列 upstream activating sequence,UAS 结合。 AD则能激活UAS下游的基因进行转录。 单独的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。 His, β-gal 一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。 His, β-gal 自激活原理 Transcription factors GAL4BD YPDA 液体 500ml 固体 100ml 蛋白胨 10g 2g 酵母提取物 5g 1g 琼脂 —— 2g 0.2%ade 10ml 2ml 葡萄糖 10g 2g YPDA培养基 0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液 pH 6.5 灭菌 121℃ 15min 正对照：pGAL4 负对照： pBD-GAL4 将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到，换单克隆重摇。 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃，230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.4~0.6。 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。 1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1×TE/LiAc重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。 （只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。 酵母菌株感受态细胞制备： 酵母转化 鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。 加入100μl酵母感受态细胞、1~2μl构建质粒（约200ng）、100μg鲑鱼精、600μl TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s~1min至混匀。 30℃，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。 加入70μl DMSO，温和颠倒混匀。 42℃水浴热休克15min，后冰浴10min。 常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1×TE重悬细胞。（ 1×TE室温只能放置1~2hr） 将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30℃倒置培养约3-5天，直至出现菌落。 阳性克隆的筛选： 将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培养基上进行筛选。30℃培养2天，检查生长情况。 对生长状态较好的单克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。 β-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析） 取2ml的Z缓冲液/X- gal溶液润透2张滤纸； 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）； 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次； 沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸上，同时吸掉多余的Z缓冲液/X-gal溶液； 沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30℃温箱3-8h，观察酵母的颜色变化。 * For the yeast two-hybrid method we also have a couple of gene constructs necessary..consturcts in yeast expression vectors so when they come into the yeast they are expressed. The first construct is the DNA binding domain