8抗体技术.pptVIP

抗体技术 　 （一）多克隆抗体(Polyclonal antibody) 1. 概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体. 2. 多克隆抗体的应用 免疫学检测 被动免疫治疗和紧急预防 3.存在问题 特异性差, 用于免疫学检测容易出现交叉反应 （二）单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb) 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体. 单克隆抗体的特性 高度均一性： 纯度很高的均一性抗体 高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定 簇起反应 大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖 之传代 杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括 （1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； （4）细胞融合； （5）杂交瘤细胞的选择培养； （6）杂交瘤细胞的筛选； （7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定； （9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立； （10）单克隆抗体的大量制备。 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 细胞融合的基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞混合，在PEG作用下融合，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释,将混合体系移入选择性培养基HAT中培养。 HAT选择性培养的原理 融合后产生脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞和未融合的骨髓瘤细胞。 次黄嘌呤（ H ）、氨基碟呤（ A ）和胸腺嘧啶（ T ） 氨基碟呤（ A ）阻断嘌呤和嘧啶的合成 HAT选择性培养的原理 骨髓瘤细胞选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型,不能利用外源性次黄嘌呤来合成自身核酸中所需要的嘌呤，而内源性嘌呤和嘧啶的合成又被氨基碟呤所阻断，不能在HAT培养基上生长。 B淋巴细胞无法在体外繁殖传代。 脾细胞内有这种转移酶，故脾瘤杂交细胞能用H和T合成DNA而得以生长。 在最适培养条件下，大约105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，通常加入饲养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞） 饲养细胞释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。 小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，应用较多。 筛选阳性克隆与克隆化 抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，所以融合后8-9天对每孔的培养上清液进行抗体活性的筛选工作，筛选出产生抗体的阳性克隆。 常用方法：酶联免疫吸附法，免疫荧光技术（适用于细胞抗原的抗体检测）和放射免疫技术。 尽早克隆化。 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 对杂交瘤细胞进行染色体分析 对杂交瘤细胞产生的单克隆抗体进行Ig类和亚类的鉴定 对单克隆抗体特异性、纯度和识别抗原的相对分子质量进行测定。 单克隆抗体的大量制备 体外培养法 在培养液中添加10%-20%小牛血清，由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100mg/ml,纯化困难。小牛血清又是支原体污染的原因。 无血清培养法：利用白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。但产量不高。 用悬浮培养方式代替静止培养法，微载体悬浮培养 多采用动物体内诱生法 杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，故选用BALB/c小鼠制备单克隆抗体。 先给小鼠注射刺激性的有机溶剂降植烷（破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境），然后注射杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。 操作简便，经济，所得单克隆抗体量多且效价高，可有效保存杂交瘤细胞株。缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。 单克隆抗体的纯化 在纯化之前必须明确其Ig类和亚类，Ig类和亚类不同，纯化方法也不同； 根据用途不同选择不同的纯化方法； 如用于体外诊断试剂的IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析亲和层析的方法。IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法； 体内诊断试剂或治疗用药物应去除内毒素、病毒、核酸等微量污染物，必须采用亲和层析和阴离子交换层析。 动物体内诱生法制备的单克隆抗体的纯化方法： 1 澄清和沉淀处理 2 分离 凝胶过滤 阴离子交