His蛋白大量纯化.docVIP

构建克隆 转化BL21 codon plus，先小摇50mlBD管子，双抗，0.3mM IPTG，25℃，5h（经验值），检测蛋白表达情况， 挑单克隆于100ml培养基中（250ml瓶），至菌液浑浊 大摇2.5L，分5瓶（2L），每瓶500ml（上限），每瓶加15ml菌液，单抗，测其OD值，至OD600在0.6-1.0之间，取菌液1ml 每瓶200μl ，0.3mM IPTG，25℃，5h Lysis buffer配制：用50 mlBD管子，加5mM 1-5mM 咪唑（5M储液，PH 8.0 4℃避光）除去非特异性，1mM cocktail，PMSF要多加（3-4倍），不可加DTT（对镍柱不利）、二价离子 将菌体取出，融化，按1L菌液加30ml lysis buffer 的比例，将菌体充分悬浮（注意吹打时将吸管插入液面以下，减少气泡的大量产生），可分次加入，将菌体转移至BD管子中，转移干净 菌体悬起后，加入1%Triton，1mg/ml的溶菌酶（1:100，可不加），转移至100ml小烧杯中，超声处理（15+15 2000s） 注意墙头插入液面以下，避免大量气泡的产生 ，此时菌液由粘稠变得一滴一滴 将超声后的菌液转入50ml大抽离心管中，配平，18000rpm 30min或14000rpm 15min 2次 Beads处理（可在超声过程中进行）：2L菌体加4mlbeads，取8ml于15mlBD管子中，500g 3min（1000rpm 5min），用不含任何东西的lysis buffer重悬，Wash2-3次（10倍Beads体积），洗去乙醇，之后分成两份用lysis buffer浸没，置于4℃冰库或冰上 将上清转入50ml管子中，将Beads也转入，留少许上清洗Beads，转移干净，4℃ 2h，孵育好后，将管子取出，静止一段时间，让Beads沉淀，缩短后面过柱子的时间 先将上清转入柱子中，再将Beads也转入，4℃，让液体流出，回收存放 先用10mM 咪唑的Lysis buffer 洗涤（总体积100ml，前50ml加1mMPMSF）（洗涤期间可轻轻吹打Beads），再用20mM咪唑的lysis Buffer洗涤（总体积100ml，不加PMSF）（PMSF影响抗体制备），Wash总体积是Beads的50倍。期间，取20mM咪唑的lysis buffer（Blank）和洗涤下来的液体（Sample）测OD280，使其 0.01 洗涤完后，将柱子下端口封住，用300mM（250mM-500mM） 咪唑的lysis buffer洗（Elution Buffer），沿壁加，EP管接收，每管大约1ml，蛋白含量最高，呈黄绿色，堵上出口，加Elution Buffer浸泡Beads PD10脱盐柱洗脱咪唑：先将保护液倒掉，5ml*5 PBS Wash，将洗脱液按由高到低的浓度梯度，2.5ml一组加入PD10柱子中，再加3.5mlPBS 洗脱，一般前0.5ml不含蛋白，用bio-rad检测后丢弃，接下来2.5ml要收集，后面0.5ml咪唑较多归入下一组 大约3-4PD10管收集后，用bio-rad测浓度（BSA对照） 考染再次测浓度，此时样品和BSA都做梯度， 将样品500μl 分装，做好标记，-80℃存放，预定时间，二楼冷冻抽干Lysis buffer:A+1mM imidazole,ph 8.0 ,用前加1%tritonx-100,1mM PMSF ,cock tail Wash buffer:A+10-20mM imidazole ,ph 8.0,用前加 1mM PMSF Elute buffer:A+250-500mM imidazole ,ph 8.0