聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶要点分析.pptVIP

实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶（垂直板状） 一、目的意义 同工酶 凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同工酶（isoenzyme） 电泳 各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素 AP-TMTED催化体系 TEMED催化AP生成硫酸自由基： S2O82－ 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： 3、采用不连续垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳(缓冲液、pH值和凝胶孔径不同) 不连续系统 浓缩效应 4、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 三、实验操作 1、电泳槽的安装 本实验使用夹芯式垂直板电泳槽：将两片干燥的玻璃板用有机玻璃条间隔开并用胶布密封好。 2、凝胶的制备 (1) 分离胶配制方法： 混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出现清晰的界面，表明聚合完成。 (2) 浓缩胶的配制： 将水倒掉，用少量浓缩胶润洗。再将配好的浓缩胶注入已凝固的分离胶上，胶液加到胶室的顶部,插入样品梳，静止聚合。胶聚合好后，小心地取出梳子，用吸水纸吸去样品槽内的水分，点样。 3、样品的制备 过氧化物酶的提取：称取1g甘薯叶柄置于冰浴上的研钵内，加入1ml样品提取液(内含 pH6.8 、0.05mol/L Tris－HCl，20%蔗糖)研成匀浆后，再加2ml提取液研磨均匀，转入离心管，于3500rpm离心15min，其上清液即为酶的提取液，供电泳分析用。 4、点样 点样：用微量注射器吸取上清液，每样品槽加样15μl，用注射器将电极缓冲液慢慢加入每槽至淹没顶部为止。最后向上、下电泳槽倒入电极缓冲液（上槽必须淹没管顶，下槽液要能浸泡着凝胶板），最后在上槽液中滴入1滴溴酚蓝溶液。 5、电泳 将电泳槽放至低温处，最好在4℃左右，或接通电泳槽水冷却系统，按上槽接“一”下槽接“＋”接好导线，通电，电泳开始电流应低，每槽1mA，10min后，再加大电流，使每槽样品达到2mA，当溴酚蓝指示剂达到距管底约0.5cm处时，切断电流，停止电泳。 6、剥胶、染色 剥胶：电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下玻璃夹心板，剥出胶片，放入培养皿中。 染色：取0.5ml联苯胺母液＋H2O 9.3ml＋0.2ml 3%H2O2，混匀后倒入盛有凝胶片的培养皿。很快就可以看到胶片上出现蓝色或棕褐色条带，即过氧化物酶带，约5-6min后用自来水冲洗，这时蓝色带也慢慢变成棕褐色。 7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率 [结果计算]： a Rf值 = ----- b 四、注意事项 安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板裂开。 染料必须现用现配。 五、思考题 简述“过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳”实验中所用的过硫酸铵、四甲基乙二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用是什么？ * * 福建农林大学生命科学院 植物生理生化实验室 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。