分子生物学检测及动物试验.pptVIP

第七节 分子生物学检测;一、细菌DNA由四个碱基组成： 　　鸟嘌呤（G）　　　　腺嘌呤（A） 　　胞嘧啶（C）　　　　胸腺嘧啶（T） 　　严格的碱基配对： 　　A＝T G＝C 　　常以G＋C碱基对的摩尔百分比来测定细菌DNA四个碱基对的含量来鉴定细菌。;二、细菌DNA提取过程 (一)细菌的培养及细菌收集 　 细菌培养：液体培养，固体培养 　 细菌收集：一般要求收集2-3克湿菌体 (二)细菌破壁 　 1. 超声波破壁法 2. 氧化铝磨碎法 3. 反复冻融法 4. 化学试剂破壁法，十二烷基磺酸钠“SDS” 5. 溶菌酶溶解法 6. 其他方法：细菌研磨法、玻璃珠研磨法。;三、细菌DNA的提取方法 (一)Marmur氯仿提取法;吸出上层含核酸的水相;注意： 1. 被溶解的细菌浓度不能太低。 2. SDS为阴离子去污剂，各厂家、批号、等级差异较大。 3. 离心分层后，取水相液体要准确。;(二)细菌DNA中G+C摩尔百分比测定 　1. 化学方法　用电泳和层析等技术 　2. 物理方法　用热变性温度(目前常用方法) 　　G+C摩尔百分比测定，是细菌分类鉴定的一种重要方法。缺点：不能表达出DNA碱基的排列顺序。;核酸杂交技术;一、核酸探针(DNA探针) 　　就是指带有标记物的，能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸序列片段。 　　(一)核酸探针的种类;1. NDA探针 　　DNA探针是目前最常用的核酸探针，因具有三 大优点： 这类探针克隆在质粒载体上，可无限繁殖，取之不尽； DNA探针与RNA探针相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性； DNA探针标记方法较成熟，制备方法简便。;2. CDNA探针 　　CDNA是指互补于mRNA的DNA分子(complementary DNA)， CDNA是由RNA经反转录产生的，这种DNA探针不含有内含子序列，尤其适用基因表达检测。 3. RNA探针 　　是一类很有前途的核酸探针，常用细胞mRNA和病毒RNA， 具有高杂交效率。但易降解，标记复杂之缺点。;4. 寡核苷酸探针 　　根据某一特殊核酸序列，选择其中最稳定区域，经人工合成，为18~30个碱基，能识别一个碱基。;二、标记物 　　32P 　半衰期 　14.3d 　　35S 　半衰期 　87.1d 　　14C 半衰期 　　125I 　 半衰期 　 60d 　;三、基因重组载体 　　载体的功能是将一个外源基因导入受体细胞 　　具体的条件 　　1. 其本身是复制子，能自我复制。 　　2. 分子量小，带有选择标记。 　　3. 对几种限制性内切酶有单一切点。 　　4.并有一定非必要区，允许外源基因插入。;Southern 印迹杂交;一、待测核酸样品的制备;二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA;三、转膜;四、杂交 (一)预杂交 　　DNA片段与探针进行杂交前必须先进行预杂交，因能结合DNA片段的膜，同样能结合探针DNA，所以须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。 (二)正式杂交;五、放射性自显影 　　用放射性同位素标记dNTP（2’-单脱氧核苷酸），测定核酸序列是应用最早。;Northern 印迹杂交(Northern blotting);二、步骤;原 位 杂 交;临床标本;斑 点 杂 交;免疫印迹法(immunoblot);基本原理：是将凝胶电泳与固相免疫测定两种方法结合起来的一种技术。;应用范围： 　　1. 病原体抗原的鉴定与分析，筛选寻找特异性抗原。 　　2. 抗体的鉴定与分析，分析患者对不同抗原组分的抗体应答状态，目前用于艾滋病的诊断。 　　3. 免疫复合物的分析。;一、基本原理： 是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，但反应体系较为简单。 包括变性-复性-延伸三步循环反应。 (1)变性：通过加热(95℃)使双链DNA解开成单链DNA。 (2)退火(引物粘合)：当温度突然降低时(55℃)，浓度很高的引物与其互补的模板在局部形成杂交链，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3’-OH末端。;（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4种dNTP及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化引物在3’端不断延伸，在模板DNA链上形成新链，从而使模板DNA扩增1倍。 （4）在DNA聚酶作用下，引物扩增延伸，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加一倍，而新合成的DNA又作为下一循环的模板，经过25-30个循环后原DNA量增加至106-109倍（拷贝）;;;;引物的要求： ▲　长度在15-30 bP ▲　G+C含量应在45-55%之间 ▲　碱基分布均匀，避免连续出现4个以上 ▲　自身无互补序列 ▲　两个引