ELISA的原理与应用-4-5.5.ppt

ELISA 知识简介; 用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性; ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。;1.　ELISA的原理 2.　ELISA的类型 3.　试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.　对照设定 5.　标本的采取和保存 6.　结果判断 ;酶免疫测定类型 ;1.1　抗原抗体反应 ;1.1.2　特异性 ;1.1.3　最适比例 ;1.1.4　敏感性;1.4　免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。;ELISA原理图;ELISA基本的实验过程;;2　ELISA的类型;2.2.1　双抗体夹心法测抗原;获得待分析物的未标定抗体;2.2.2 双抗原夹心法测抗体;;Hook Efect（钩状效应）：过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，此现象称为钩状效应 ;2.2.3 间接法测抗体 ;包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体 ;2.2.4 竞争法测抗体 ;2.2.5 竞争法测抗原;用已知特异性 抗体包被 固相载体 ;2.2.6 捕获包被法测抗体;2.2.7 ABS-ELISA法 ;3. ELISA的试剂(A、B、C三部分);ELISA的试剂准备A ;3.1.2 　包被的方式;不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。;包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 ;3.1.4 　包被用抗体;3.1.5 　包被的条件;3.1.6 　封闭;3.4 　洗涤液 　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。;　ELISA的试剂准备B ;3.2.1 　结合物用的抗原和抗体;;3.2.3 　结合物的制备;（2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合。 简便有效. 该法仅用于HRP标记 此法酶标记物产率较高，但是部分结合物可能聚合，抗体的活性有所降低 酶标记物需经纯化及鉴定 ; 注意原则：结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。;3.2.4　结合物的保存;3.2.5 　结合物的稀释液;试剂准备 C 酶的底物 ;3.3 　酶的底物;TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。 ;3.3.2AP的底物 AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。;酶 ;3.5 　酶反应终止液 　　常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。;4 对照设定