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动物细胞培养技术 绪论部分 1）细胞的基本概念：细胞（包括单个个体）在体外条件下的生长，成为细胞培养。 2）组织培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌，适当温度和一定营养条件下使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 （组织培养从广义上说分为动物组织营养和植物组织营养两大类。） 组织培养常用术语 贴壁依赖性：为细胞需贴附于第五或支撑物上才能生长的性质。 细胞一代时间：单个细胞连续两次分裂的时间相隔，可借助显微电影照相术来精确确定。 群体倍增时间：在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需时间。 克隆;单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。 原代培养：从体内取出细胞或组织的第一次培养。 传代或传代培养：不论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。 细胞杂交：两个或多个不同的细胞融合导致一个含核体的形成。 细胞培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养的作用： 在病毒学上的作用（病毒的分离 细胞培养在药物学上的作用（新药的制备、药效的鉴别、病毒疫苗的生产、单抗的制备）； 细胞培养在肿瘤学研究上的作用（例如化疗中的药物使用剂量、癌症研究等） 细胞培养在细胞功能与分化研究中的应用； 细胞培养在免疫学中的应用 1)Harrison首先解剖出蛙胚原始脊髓节段进行培养。 哈里森悬滴培养法。建立起一套合理的无菌操作技术。（淋巴） 一般皆公认Harrison为“组织培养之父”，凹玻片悬滴制备培养技术，对生物学知识的研究做出十分重要贡献。 2) Carrel 反复传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶，Carrel flask)等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。 30年代传入我国，50年代逐渐发展 细 胞 培 养 设 施和 基 本 条 件 （一）细胞实验室 基本原则： 防止微生物污染和有害物的影响。和其它微生物培养不能在同一区域进行。 净化工作室 细??培养实验室区域设置 一般分三区：无菌室、缓冲间、准备室 一、准备室的主要作用 消毒和培养物质的准备以及供应物品的保藏等。 准备室内应有的设备： 水槽和盛物台、酸缸、水盆和桶、电炉和锅、物品准备台和水纯化装置、高压蒸汽消毒器、电热干燥消毒箱、储柜或储架。 二、缓冲室 1）减少外界污染源带入培养室 2）应有消毒水、无菌衣和紫外灯或臭氧机 三、无菌室（操作室或培养室 无菌室要求 1）培养室要密闭、无外窗 2）空气调节机要用中央风机 3）培养室的墙壁最好贴瓷片，墙壁要光滑无死角，地面可用水磨石或瓷砖 4）装有紫外灯，天花板不宜高过2.5米 无菌室应放置的设备： 超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、真空泵或气泵、冰箱、杂物柜、小型低速离心机 。 （二）超净工作台 原理：鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，通过工作台面，形成无菌环境。 按气流方向可分为外流式和侧流式： ①外流式：净化的气流朝操作者方向流动。 ②侧流式：气流从上向下或从左至右流向对侧。 使用注意事项： 每三个月清洗一次粗滤网； 根据情况更换除菌滤网； 二、常用的大型必备装置和仪器 1.培养箱：二氧化碳培养箱，CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意： ① 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ② 保持培养箱内空气干净，定期消毒。 ③ 箱内灭菌蒸馏水，也可加入防腐剂以保持箱内湿度，避免培养液蒸发 2.倒置显微镜： 了解细胞生长情况，及时发现污染和污染类型。 注意事项: 在照明期间,注意不要触及灯泡和集光镜，不要将易燃物质靠近灯泡； 随时关闭电源 3、冷冻保存装置 细胞培养中常需储存细胞，常用的是液氮容器。 液氮罐为双层结构，中间为真空层。内胆颈部与体部经焊接相连。 总的来说，可分为窄颈瓶和宽颈瓶。 使用时应注意事项： 1、搬动和装入液氮时，要小心缓慢加入； 2、由于液氮不断挥发，经注意观察存留液氮情况，及时定期补充，防止挥发过多而致细胞受损。 4.冰箱 -20 ℃ 。 粉状培养基、消化酶、谷氨酰胺要贮存在4℃； 血清、配制的抗生素、谷氨酰胺溶液等，需长期冷冻。 如有条件，可配置-80 ℃冰箱 5.水纯化装置 (1)自动双重纯水蒸馏器： (2)自动纯水仪 双蒸器使用应注意事项： 1、使用时先开启冷却水水源。 2、要调节去离子水或蒸馏水流速，使之进入一次横式烧瓶的速度基本上与二次横式烧瓶的流出速度相等。 3、停用时应先关闭去离子水，再关闭电源，最后关闭冷却水。 4、不可用普通自来水蒸馏。 5、不宜使用存放数日的三蒸水。 新购回的蒸