ROCK抑制剂法舒地尔对脂多糖致大鼠肺微血管内皮细胞损伤的保护作用与机制研究.pdf

附图…………………………………………………………………．．89 讨论……………………………………………………………………102 小结……………………………………………………………………104 参考文献………………………………………………………………105 结论…………………………………………………………………………108 综述肺微血管内皮细胞损伤与肺动脉高压……………………………109 致谢………………………………………………………………………．．128 个人简历…………………………………………………………………．．129 中文摘要 ROCK抑制剂法舒地尔对脂多糖致大鼠 肺微血管内皮细胞损伤的保护作用及机制研究 摘 要 细菌性脓毒症及其伴随的严重的并发症是临床常见的、威胁生命的疾 病。而所有这些并发症的一个共同点就是内皮细胞损伤和功能障碍。肺微 血管内皮细胞(PMVECs)是肺组织的重要实质细胞，在肺损伤过程中既 是首位受损伤的靶细胞，又是活跃的炎症细胞和效应细胞，在疾病发生发 展中起关键作用。因此，深入探讨PMVECs损伤机制在肺循环疾病的研究 中至关重要。 感染尤其是革兰氏阴性菌脓毒症是急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征 阴性杆菌外膜上的一种糖蛋白，在体内可引起强烈的炎症反应，直接或间 激下PMVECs损伤的调控机制涉及复杂的信号转导途径。研究发现，在 信号通路，在细胞的信号转导过程中起着信号转换器或分子开关的作用， 能够诱发肌动蛋白细胞骨架重排、调控基因转录及细胞周期进程等。然而， 他信号通路的交叉反应尚需进一步研究。因此，本实验以LPS诱导大鼠 并通过细胞免疫化学、流式细胞术、激光共聚焦及细胞分子生物学等技术 探讨其下游信号转导机制。 变化及可能机制。 方法：组织贴块法原代培养大鼠PMVECs，Ⅷ因子相关抗原免疫细 胞化学染色及透射电镜观察细胞超微结构鉴定大鼠PMVECs；MTT及乳 中文摘要 mRNA的表达；Westernblot检测MYPTl磷酸化水平。 结果： 1PMVECs体外培养及鉴定 采用组织贴块法并加以改良成功培养出大鼠PMVECs，去除组织块继 续培养3,--5天后，基本形成细胞单层，汇合呈典型的铺路鹅卵石状排列。 VIII因子相关抗原免疫细胞化学染色表明，约95％的细胞表现为阳性。电 镜结果表明t多数细胞均可观察到质膜突起，即微绒毛；在细胞浆中还观 察到W-P小体；另外有大量的质膜小泡(又称吞饮小泡)存在于细胞浆 内，上述结构符合典型的内皮细胞超微结构特征。结合我们的取材部位为 肺外边缘组织，因此可以证实分离培养的细胞的确为肺微血管内皮细胞。 2LPS对大鼠PMVECs细胞生长的影响及法舒地尔的干预作用 4-O．12)相比，O．01、O．1、 MTT实验结果表明：与对照组(OD值为0．95 l LPS对大鼠PMVECs生长没有明显影响；而10、100LPS处理 lxg／ml lxg／ml 组OD值分别降为0．754-O．19(PO．05)和O．50 LPSI邑明显造成PMVECs损伤，但又不至于导致 生长明显抑制。10]xg／ml 损伤过重，仍留有足够数量的细胞进行后续实验，因此，初步选定用10 LPS制作PMVECs损伤模型。10LPS作用6h和12h时对细胞生 gg／ml rtg／ml 长没有明显影响，作用24h时OD值为0．734-O．19，与LPS作用0h(OD值 为0．93 h和 72 h时，仍处于较低水平。25，50 h导致 oM法舒地尔预处理对LPS作用24 的细胞损伤有不同程度的改善(与LPS组相比，尸