棉花ARG基因正义反义植物讲述.ppt

棉花Arg基因正义、反义植物 表达载体构建 勾践组 载体 vector 表达载体 载体 克隆载体 原核表达载体 真核表达载体 植物表达载体 正义植物表达载体 反义植物表达载体 载体 载体 载体 表达载体 克隆载体 Arg基因：精氨酸基因载体（vector ）：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。 表达载体构建正义和反义：一般用于基因功能的研究,正义为强势表达，以观察基因表型,反义则是用来抑制基因表达,以观察在目的基因的表达受到抑制的情况下表型的变化. 实验准备工作 材料： 棉花Arg基因的RNA、感受态细胞DH5α、 植物表达中间载体pCAMBIA1302、 pＭＤ19—T载体、 DNA连接酶、卡那霉素、 氨苄青霉素 试剂： 各种限制性内切酶、DNA链接试剂盒、 2×EsTaq Master Mix、ＤＬ2000、 胶回收试剂盒、小量质粒小提试剂盒、 10×Tango buffer 目的基因的扩增 T载体构建 T载体构建的筛选 pCAMBIA1302构建 pCAMBIA1302构建的筛选 实验流程图 提取棉花 Arg mRNA RT cDNA ——GAR 反义 ——ATG 正义 PCR pMD19—T pMD19—T—ATG pMD19—T—GAR pCAMBIA1302 酶切 pCAMBIA1302—ATG pCAMBIA1302—GAR 筛选 筛选 酶切 pCAMBIA1302正义表达载体的构建 bgl Ⅱ 、nhe I 双酶切 T4连接酶 pCAMBIA1302 pCAMBIA1302 bgl Ⅱ nhe I bgl Ⅱ bgl Ⅱ nhe I nhe I 目的基因 目的基因 一、棉花ARG目的基因扩增棉花ARG基因克隆载体为模板，利用正义载体引物F1/R1，反义载体引物F2/R2分别扩增正义目的基因、反义目的基因。上下游引入酶切位点： bglⅡ（ACTAGT）、 nheⅠ（GCTAGC）反应体系：1、 2×Es Taq Master Mix—10uL 2、上下游引物（10umol/L）各加0.5uL 3、模板—0.5uL  4、用水补足至20uL PCR反应条件： 1、94℃预变性2min后 5、最后72 ℃延伸7min PCR反应结束后，1﹪琼脂糖凝胶检测扩增产物，将扩增 产物从胶中回收 2、94 ℃变性30s 3、51 ℃退火40s 4、72 ℃延伸90s 循环40次 二、T载体的构建 将扩增产物从胶中回收，连接到pＭＤ19—T载体上，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建含有棉花ARG正义基因载体pＭＤ19—T—ATG、反义基因载体 pＭＤ19—T—GAR 三、T载体构建载体的筛选 将转化的大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩繁（液体LB培养基37℃过夜摇菌），涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上 培养后筛选出阳性菌，进行PCR，然后电泳，根据电泳结果筛选出真阳性，扩繁。 将阳性菌进行测序，进一步验证构建的是 棉花ARG正义基因载体pＭＤ19—T—ATG 反义基因载体pＭＤ19—T—GAR 四、pCAMBIA1302构建 用质粒小提试剂提取含有棉花ARG 正义基因载体重组质粒pＭＤ19—T—ATG 反义基因载体重组质粒pＭＤ19—T—GAR 然后用限制内切酶bglⅡ/nheⅠ分别对 重组质粒pＭＤ19—T—ATG 重组质粒pＭＤ19—T—GAR进行双酶切。 酶切体系：1、含质粒ＤＮＡ—１０ｕＬ 　　　　 ２、bglⅡ/nheⅠ各０.２ｕＬ 　　　　　３、10×Tango buffer加1uL 4、用水补足体系至20uL 37 ℃酶切3—4h1﹪琼脂糖凝胶检测酶切产物，回收小片段 植物表达载体pCAMBIA1302同样用限制内切酶bglⅡ/nheⅠ进行双酶切 酶切体系：1、 pCAMBIA1302—10ul 　　　　　２、bglⅡ/nheⅠ各０.２ｕＬ 　　　　　３、 10×Tango buffer加1uL 4、用水补足体系至20uL 37 ℃酶切3—4h1﹪琼脂糖凝胶检测酶切产物，回收大片段