酶工程酶提取纯化方法讲述.pptVIP

生技1班 2组 姚晓红 董田玉 卜亚谦 陈晓萌 张晓宁 赵丛林 酶的分离纯化方法 根据酶的溶解度差异分离—沉淀、盐析等 根据酶分子大小的差异分离—透析和超滤 根据酶的电荷差异分离—电泳、离子交换等 根据酶与某些物质的吸附差异—吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析 一. 盐析沉淀法 1.基本原理（掌握） 2.盐析用盐的选择 3.盐析操作（掌握适用范围） 4.盐析法的优缺点 （二）盐析法分类 Ks分段盐析法 ：在一定的pH和温度条件下，通过改变 离子强度使不同的酶或蛋白质的分离的方法。 β分段盐析法 ：在一定盐和离子强度下，通过改变溶 液的pH及温度使不同的酶或蛋白质的分离的方法。 分段盐析：不同蛋白质分子量，表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出的盐析方法。 总结 二. 等电点沉淀法 1.基本原理（掌握） 2.使用方法 3.优缺点 （一）基本原理 两性电解质在等电点时溶解度最低 不同的两性电解质具有不同的等电点 （二） 使用方法 因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法） 注意： 1.在调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进，以防局部过酸或过碱而引起酶变性失活。 2.应选用具有相同离子的酸或碱缓冲液。 （三）优缺点 1. 优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 2. 缺点： 加酸或加碱时，容易引起蛋白质失活 总结 三. 有机溶剂沉淀法 1.定义及基本原理（掌握） 2.有机溶剂的选择（理解） 3.常用有机溶剂（了解） 4.优缺点 三 、有机溶剂沉淀 利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 （一）基本原理 降低溶液的介电常数，增加酶分子分子间的静电引力，导致酶分子的溶解度下降； 部分地引起蛋白质脱水，而使酶分子趋于凝集、沉淀。（有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了分子周围的水膜厚度，降低其亲水性） （二）有机溶剂的选择 沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑以下几个方面的因素： （三） 常用有机溶剂 丙酮?乙醇?甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 （四）优缺点： 优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 总结 四. 共沉淀法 1.定义及基本原理（掌握） 2.应用举例 四、共沉淀法 （一）基本原理 利用离子型表面活性剂如SDS、非离子型表面活性剂如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）、聚乙烯亚胺以及单宁酸、硫酸链霉素等，在一定条件下能与酶或杂质直接地形成络合物，使酶或杂质沉淀析出，从而达到纯化的目的。 （二）共沉淀法例子 以聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)纯化限制性内切核酸酶RE. EcoR I为例。 在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中，包含大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/L KCl的条件下，能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出；但当KCl的浓度上升至0.6 mol/L时，虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态，而RE. EcoR I却能重新溶解，因此可将酶和杂蛋白分离开来，使RE. EcoR I得到初步纯化。 总结 总结 方法 原理 所用试剂（条件） 适用范围 盐析沉淀法 硫酸铵 硫酸钠等 蛋白酶 等电点沉淀法 酸或碱 蛋白酶 有机溶剂沉淀法 丙酮 乙醇等 蛋白酶 核酸酶 共沉淀法 选择性变性沉淀法 单宁 聚乙二醇等 蛋白酶 核酸酶 * 再说一下硫酸铵的缺点，书79 内容 据溶解度不同纯化酶的方法 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性变性沉淀法 适用于所有酶吗？ （蛋白酶，核酸酶） 1 2 3 4 5 6 1.0 2.5 2.0 0.5 -0.5 -1.0 -1.5 0 1.5 碳氧血红蛋白的lgS与(NH4)2SO4离子强度I的关系 pH6.6 T=25℃ S0=17g/L S0 β I (离子强度) lgS 盐析 盐溶 蛋白质溶解