酶的分离技术.讲述.ppt

酶法分析：用酶进行物质分析检测的方法称为酶法检测或酶法分析。 酶法分析包括两个步骤： 1.酶反应：将酶与样品接触，在适宜的条件下（T、pH、抑制剂和激活剂）进行催化反应。 2.检测：测定反应前后物质的变化情况，底物的减少或产物的增加。 化学检测法 光学检测法 气体检测法 一、单酶反应检测 利用单一种酶与底物反应，然后用各种方法测出反应前后物质的变化情况。　 举例：L-谷氨酸脱羧酶 L-谷氨酸 γ-氨基丁酸 CO2 酶：游离或固定化 CO2检测：华勃氏呼吸仪或二氧化碳电极 二、多酶偶联反应检测 利用两种或两种以上的酶的联合作用，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定被测物质的量。　 举例：葡萄糖氧化酶与过氧化物酶 葡萄糖+O2 葡萄糖酸＋H2O2 CO2 H2O2 H2O＋［O］ ［O］＋还原型邻联甲苯胺 氧化型邻联甲苯胺 三、酶标记免疫反应检测 酶标抗原 ＋ E E 酶标抗体 ＋ E E 酶－抗原－抗体复合物 ＋ E E 举例：碱性磷酸酶 硝基酚磷酸 硝基酚＋ 磷酸 E A420 * * * * * * * * * 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种： 1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。(保护位点多,可修饰位点多;蛋白容易失去活力) 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。 (5) 氨基酸置换修饰 酶分子的定点突变 1、基因序列分析 2、蛋白质结构分析 3、酶活性中心分析 4、引物设计进行基因定点突变 5、酶基因克隆表达 6、变异特性分析 (6) 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，(与前五种方法区别)酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。 第四节 酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。 第五节 酶的定向进化 酶分子的合理设计(rational design) 定点突变技术属于合理设计,这个技术需要对酶蛋白结构和功能间对应关系要有了解.通过设计酶结构而得到一些功能. 酶分子的定向进化(directed evolution) 包括易错PCR技术,无须对蛋白结构和功能间对应关系有了解,先突变大量酶,再根据具体功能需要选择合适的酶,再了解酶结构. 两种方法在酶结构和关系间建立联系,不段推动对酶蛋白结构和功能了解.两者联合设计新酶可取得不错效果 酶的合理设计 定向进化的原理 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的 定向进化产生突变库手段-易错PCR 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’-5’校对功能的性质，(或则不含镁离子含锰离子的聚合酶)配合适当条件，向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，