生化实训琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 唐琳 CONTENTS 原理 步骤 注意事项 原理 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 原理 琼脂糖凝胶电泳 用琼脂糖作支持介质的一种电泳技术。 琼脂糖 一种线性多聚物。在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。 原理 琼脂糖凝胶具有网络状结构。 原理 物质：小于孔径的物质可以快速通过，而大于孔径的物质则会受到阻力。其结果是可以区分不同大小的分子。 浓度：凝胶的浓度不同，形成的孔径大小也就不同。 浓度越大，孔径越小。 琼脂糖凝胶电泳现主要应用于核酸研究中。 “分子筛效应” 原理 核酸 由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。 原理 核酸的两性解离 核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱性的碱基，故为两性电解质，可发生两性解离。 其解离状态随溶液的pH而改变。当核酸分子的酸性解离和碱性解离程度相等，所带的正电荷与负电荷相等，此时核酸溶液的pH就称为等电点（isoelectric point, 简称pI）。 原理 胞嘧啶核苷酸(CMP)的解离 原理 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动。 DNA属于碱稳定性物质 核酸都带负电，在电场中沿同一方向 移动，再利用“分子筛效应”，就可用 电泳的方法将不同大小的核酸分离开来。 CONTENTS 原理 步骤 注意事项 步骤 1.电泳缓冲液 常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE等。一般选取TAE，配为50x浓度，用前需稀释为1x。 作用： ①缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。 ②电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于核酸分子的迁移。 ③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防 止镁离子与核酸生成沉淀。 步骤 2.琼脂糖凝胶的制作 分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表。? 凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 步骤 DNA样品为200-2000bp。 用作配胶的溶液应与电泳缓冲液完全一致。 注意：制胶过程中应加入EB（溴化乙锭），是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配，可能具有高致癌性。注意做好防护措施。 步骤 步骤 3.电泳 步骤 （1）点样 样品已制备，加入点样孔中。如有气泡，应轻轻赶出。 （2）电泳 确定正负极，接通电源开始电泳。样品中已加入loading buffer，可以指示样品的位置。 4.照胶、结果分析 步骤 溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD 成像头的凝胶成像处理系统拍摄。 步骤 CONTENTS 原理 步骤 注意事项 注意事项 拟定具体实验方案（30%） 详细的实验具体步骤，药品选用及理由。竞赛时只可带入自己的实验方案。 操作过程（50%） 结果分析（20%）