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生化实验总结 第 小组制作 成员：‘ 实验内容 实验回顾 实验总结 实验收获 实验内容 实验内容 移液管和微量可调式移液器的使用、校正与误差分析 一 血清碱性磷酸酶活性测定 三 五 血清葡萄糖浓度的测定（GOD-POD法） 七 质粒DNA的提取 九 721E分光光度计的原理与操作联系 二 血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离 四 酶的竞争性抑制 六 血清GPT活性测定 八 DNA琼脂糖凝胶电泳 十 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 实验二：721E分光光度计的原理与操作联系 该实验要求掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作方法，以及学习末知溶液的浓度测定方法，并通过实验制作CuSO4标准曲线，求得未知CuSO4溶液的浓度。 了解Lambert-Beer定律： 吸光度 （Absorbance） 吸光系数 液层厚度 溶液浓度 A=kLC 实验一：移液管和微量可调式移液器的使用、校正与误差分析 该实验主要练习使用刻度移液管、微量可调式移液器，以及对测量数据进行准确度和精确度的评估，计算量具容量的校正值、 实验三：血清碱性磷酸酶活性测定 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。在PH=10的环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解 生成 苯酚和磷酸氢二钠苯酚，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物，测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小。 磷酸苯二钠+H2O 苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物  ALP pH=10 铁氰化钾 实验四：血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离 凝层层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝层颗粒，颗粒内部具有三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经层析柱，大颗粒物质因其直径大于凝层网孔，不能进入凝层颗粒内部，只能沿着凝层颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小颗粒组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝层颗粒内部，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。 实验五：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组成、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH=8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 实验六：酶的竞争性抑制 竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。 草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色）作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。 实验七：血清葡萄糖浓度的测定（GOD-POD法） 葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放出过氧化氢。后者在过氧化物酶（peroxidase，POD）的作用下与色原性氧受体4-氨基安替比林偶联酚缩合成红色醌类化合物，即Trinder反应。该红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。 酶法测定血清葡萄糖是以过氧化物酶的偶联酶反应定量法 葡萄糖+ O?+H?O→葡萄糖酸+2H?O? 2H?O?+4-氨基安替比林+苯酚→红色醌类化合物 实验八：血清GPT活性测定 α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合生成相应的苯腙，在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在250nm比色时，丙酮酸-2,4-二硝基苯腙的光密度值远较α-酮氏二酸苯腙高。反应30min后，α-酮氏二酸量减少而丙酮酸量增加，在一定范围内，520nm处光密度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮氏二酸的摩尔比例呈线性关系。 丙氨酸+α—酮戊二酸 谷氨酸+