03 细胞生物学研究方法 黄宜兵 吉大.pptVIP

一、光学显微镜技术（light microscope） 普通复式光学显微镜技术 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜（differential interference microscope） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscope） 荧光显微镜技术（fluorescence microscope） 激光共焦扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscope） 荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer, FRET） 荧光漂白恢复技术（fluorescence photbleaching recovery, FPR） 与普通光学显微镜相比，荧光显微镜的光源和光学系统不同，其核心部件为滤光片系统和专用的物镜镜头： A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。 B.滤片：根据性能分为两组。 一是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。 二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。 电镜与光镜的主要区别 观察标本内部细微结构 三、免疫细胞化学（immunocytochemistry) 根据免疫学原理，利用抗体同特异性抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。 抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特异的抗原分泌的r球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 体内：免疫荧光与免疫电镜 体外：免疫印迹western blotting，放射免疫沉淀 标记物可以分为多种： 荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法 酶─酶标抗体法 放射性同位素标记—放射自显影 铁蛋白标记 免疫胶体金技术 常用标记物：荧光素、酶。 常用荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明； 常用的酶：辣根过氧化物酶。 原位杂交（in situ hybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术。染色体在高pH值条件下，DNA解链，带标记的核酸探针即刻与染色体一定部位杂交。既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。 带放射性的DNA探针，放射自显影；免疫探针法。 五、流式细胞术 仪器：流式细胞仪—flow cytometry 特点：细胞是高速运动的 主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞。 1. 荧光漂白恢复（fluorescence photobleaching recovery;FPR ） 借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子发生不可逆的粹灭，称为光漂白，随后，由于细胞中脂质分子或者蛋白分子的迁移，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，使光漂白区域的荧光强度逐渐恢复到原有水平。这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,从而得到活细胞的动力学参数。 该方法主要研究膜蛋白和脂质平移扩散以及溶质通过质膜和在细胞内转运。包括三个步骤：荧光染料与膜成分交联；激光照射猝灭（漂白）膜上部分荧光；检测猝灭部位荧光再现速率（由于膜成分的流动性）。 2. 酵母双杂交系统yeast two-hybrid system 将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。 3. 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET） 荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100?），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。 2. 突变体制备技术 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是利用一段特异的双链RNA或单链反义RNA通过注射、转染或者转基因的方法导入到细胞或者模式生物中，这样的RNA可以启动一套信号通路来最终降解与这段RNA对应的，通常是包含这段序列的mRNA，使其无法翻译成相关蛋白质，从而特异性的剔除或关闭特定基因的表达。该技术已被广泛