原生质体的培养与融合精要.pptVIP

第十一章 原生质体的培养与融合 原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 第一节 原生质体分离及纯化 一、原生质体分离 多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。 1、机械分离法（Machanical isolation） （2）酶液的配制 （3）分离原生质体 二、 原生质体纯化与活力测定 1、 离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 步骤： 第一步：400目网筛过滤。 第二步：滤液和高渗溶液混合，离心。 第三步：小心吸取上层原生质体，洗涤液重复洗2-3次。 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。 1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 1）0.1%酚番红染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 2）0.025%Evans蓝染色：有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 第二节 原生质体培养 一、培养基 二、培养方法 原生质体融合 番茄+马铃薯 二、融合方法 (一)无机盐诱导融合: NaNO3法 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。 （二）高pH-高Ca离子法 （三）PEG法 （四）PEG结合高钙-高pH诱导法 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞 异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色 4-4 同功酶鉴定 根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。 本章小结： (1) 原生质体培养的意义： (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3) 原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。 (4)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。 (5)原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 本章小结： （6）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。 （7）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种细胞法；双荧光标记选择法 （8）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察；DNA多态性分析；同工酶分析 PEG法特点： 融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低 植物+植物 植物+动物 动物+酵母 Polyethylene Glycol（聚乙二醇） PEG法原理 PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。 PEG法示意图 - + - 桥梁 + - PEG被洗掉 + - + - 电荷重排 + - + - + - + - 膜接触 (五)电融合技术 Senda 首先用此方法实现原生质体融合 细胞融合仪 电融合法原理 交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。 + - 负极 正极 + - + - + - + - + - + - + - + - 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 + - + - + - + - + - + - + - + - 原生质体的融合过程： 三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定 1．互补选择法 2、机械分离杂种细胞法 3. 双荧光标记选择法 3. 双荧光标记选择法 四、体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定 细胞学观察 DNA多态性分析 同工酶分析 4-1、形态学鉴定 4-2、细胞学观察 染色体形态和数目的比较 18条染色体 36条染色体 4-3 DNA多态性分析 RAPD带型 （随机扩增的多态性DNA） * * 原生质体的分离与纯化 原生质体培养 原生质体融合 本章主要内容 微 丝 叶绿体 线粒体 质 膜 细胞核 内质网 微 管 细