研究生分子生物学实验资料.pptVIP

SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS-多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关。 加速剂TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵用作单体聚合引发剂，催化剂。过硫酸铵产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。 仪器设备 Bio-rad(伯乐) 浓缩胶 分离胶 1cm Western Blotting (免疫印迹) 封闭 一抗 二抗 显色 SDS转膜 血清封闭 一抗 二抗 显色 显色方法 ECL(HRP) AP 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * Operation Weigh proper 0.3g agarose, dissolve in 30ml TBE buffer by heating in a microwave oven （称取琼脂糖0.3克溶于30ml 1×TBE buffer，微波炉加热熔化） 2. Gel bed can be made by sealing a proper sized plastic with the masking tape and inserted the comb （胶带封闭胶床，插梳子） 3. Cool agarose gel to 60℃, add 5μl EB, mix, pour the agarose slowly (avoid bubbles) onto the gel bed （冷却，加EB混匀，倒入 胶床） 4. Let gel polymerize for about 30min, discard the masking tape, place the gel bed onto the electrophoresis tank, remove the comb （30min后，撕去胶带，放入电泳槽，拔出梳子) 5. Fill the tank with proper amount of TBE buffer, usually the buffer is about 1 mm above the gel （加入TBE buffer，让液面略高于胶面） 6. Add 2μl loading buffer and 7μl sample onto a piece of parafilm, mixed, add DNA sample slowly with the pipette tip just beneath the opening of the well (avoid bubbles in tip)（上样） 7. Electrophoresis (80mA) about 30min （恒流80mA，电泳30min） 8. Observe DNA fragments under UV light （紫外灯下观察结果） 目的基因686bp,蛋白分子量34kd 质粒提取 1、离心收集3ml培养液中的菌体，用250ul重悬液 重悬菌体。 2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。 3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离心10分钟。 4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分钟，弃去收集管中溶液。 5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm  离心1分钟，弃去收集管中溶液。 6、加入250ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。 7、10000rpm离心2分钟，弃去收集管中溶液。 8、将离心柱转移到干净1.5ml EP管中，加