第四章抗体制药-1！.ppt

抗 体 制 药(一) 本章目的要求 1、掌握单克隆抗体的概念。 2、理解制备单克隆抗体的一般流程。 3、理解基因工程抗体的制备。 4、理解噬菌体抗体库的基本方法、技术特点及基因工程抗体的表达。 5、掌握抗体诊断试剂的分类。 学习内容（一） 1、抗体制药概述 2、单克隆抗体制备的基本过程。 3、基因工程抗体。 第一节 概 述 ?1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。 ? 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。 ?70年代中期，日本利根川进证实了Ig的基因结构，获得1987年的the Nobel prize。 抗体？ 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 抗体的产生？ 机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。 多克隆抗体 polyclonal antibody 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。 实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 ? 抗破伤风， 副作用：?超敏反应 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 -- 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。 单克隆抗体 monoclonal antibody，McAb 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。 第二节 McAb及制备 一、 McAb 1、McAb定义 是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的针对一个抗原决定簇的高度特异性和专一性的抗体。 2、McAb怎样产生？ 是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。 二、McAb的制备 1、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。 为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。 目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。 免疫方法 采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。 可溶性抗原按每只小鼠10～100?μg抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。 一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，刺激B细胞分裂。 脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。 体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。 优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。 体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5% CO237 C 下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 细胞融合的方法 脾细胞（1×108） 骨髓瘤细胞（2～3×107）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。 PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。 用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。 细胞融合后可产生多种融