基因载体的选择与构建教程分析.pptVIP

1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选 1）用限制性酶消化 DNA 样品 粘性末端 3）连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 冷循环器 4）用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。 5）细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选 筛选会有三种结果： 一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成； 二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落； 三是要插入的序列与质粒相连，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。 倒平板 加IPTG和X-GAL 乳糖和诱导物IPTG的化学结构 X-gal X-gal水解 筛选结果 蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码的功能性的 α 片段 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片段 筛选结果模式图 蓝菌落 蓝白菌落 Thank You! isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 筛选白色菌落 二、噬菌体载体与黏粒载体 一）噬菌体载体 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 噬菌体 (电镜图） 　1、λ-DNA的物理图谱 λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。 特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。 cos位点的作用 2、感染周期 噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入 ： （1）吸附 （2）DNA注入 （3）DNA复制 （4）包装: 只能包装λ-DNA分子的75%-105% 即包装范围为36.4kb-50.9kb的DNA （5）裂解 吸附 穿入 生物合成 成熟、释放 毒性噬菌体的溶菌性周期 温和噬菌体的溶菌性周期 温和噬菌体的溶源性周期 前噬菌体 λ噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 531bp，含50多个基因。 二） λ－DNA载体的构建 建立λ克隆载体前需要解决两个问题：　　 1） λDNA分子只能增加5%的大小，即只能插入3kb的DNA分子。　　 2） λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ基因组。 * * 第三章 基因载体的选择与构建 一、载体的功能、特征及质粒载体 克隆载体（clony vector）：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。 目前基因工程中常用的载体有： 细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体等。 一）载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二）载体应具备的特征条件 1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 三）质 粒 （plasmid） 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。 ★不是细菌生长所必需的 ★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★分子量在1-200kb之间 1、质粒的基本特性 （1）自主复制性 携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 （2）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存 （3）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类