基因工程-教程分析.pptVIP

目的基因与质粒载体的连接 连接时考虑因素 粘末端连接 定向克隆 平末端连接 同聚物加尾法 加人工接头连接法 目的基因与噬菌体载体的连接 实验步骤要尽可能简单易行; 连接形成的接点序列，应能被某种酶重 新切割，便于回收插入的外源片段； 对转录和转译过程中密码结构的阅读不 发生干扰； 用两种不同的限制酶消化后，应通过凝胶电泳或排阻层析纯化载体大片段，以便切下来的小片段分开； 尽量避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的 酶切位点； 必须检查两种限制酶对载体的消化是否完全 目的基因和载体双酶切反应 盐浓度相同，用同种buffer； 选择易产生星号活性的酶的缓冲液； 酶活性大于50%可选同一种缓冲液； 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解； 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 人工接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（10-12bp），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段。 载体臂与外源DNA片段的比例 0.25:1—8:1 两种DNA片段在连接混合液中的浓度 1、受体细胞 2、 转化方法 3、 转化率 安全性高，无致病性； 具有较高的转化效率； 具有接受外源DNA的能力； 一般应为限制酶缺陷型，使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 一般为DNA重组缺陷型； 具有与重组体互补的遗传性状，便于重组体的筛选； 受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性； 具有较好的转译后加工机制，便于真核的基因的高效表达； (2)各种生物受体细胞的特性 转化技术成熟,各种操作技术成熟； 基因组简单； 繁殖迅速，成本低； 试验周期短。 真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆，然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。 优点: 真核蛋白表达后可以正确的加工,折叠,糖基化。 缺点: 相对操作技术复杂,繁殖周期长,培养成本高。 酵母：易繁，结构简单遗传背景清楚，具有分泌特性。 植物：全能性，成本低，高等生物加工方式。 动物：内含子去除，正确修饰，易转化，具有分泌特性。 昆虫：易繁，蛋白含量高。真核加工方式。 转化：带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细 胞的过程称为转化。 转染：将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过 程称为转染。 转导：重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为 有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为 运载体，将重组DNA导入受体细胞，这一 过程称为转导。 显微注射：在显微镜下，借助显微操作仪，将毛细玻 璃管直接插入受精卵原核，注入特定的外 源基因，即为基因显微注射法 。 电穿孔： 将待转化的质粒或DNA重组连接液加 在高压电场下，穿过细胞细胞壁和细 胞膜，直接打入细胞内。 基因枪： 以氦气为动力，把DNA用金粉或钨粉 包裹，直接发到细胞、组织或器官， 通常是植物材料。 利用物理方法导入、转化 1.质粒的Ca2+诱导转化 2.质粒的原生质体转化 3.质粒的高压电穿孔法转化 4.显微注射法转化 5.基因枪 利用生物方法导入、转染 1.细胞噬菌体DNA的转染 2.动物病毒DNA的转染 3.植物病毒DNA的转染 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术。 原理：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构， 后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空 隙，此时最易接受外源DNA片段并实现其转 化，细菌细胞这种生理状态叫做感受态。 1） 细胞的生长状态 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用 于制备感受态细胞的菌液。 2） 细胞生长密度控制