紫球藻藻红蛋白β亚基基因的克隆及在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

摘要 摘要 藻红蛋白潜在的生物活性引起了广泛的重视，如体外的抗氧化活性以及作为光敏剂用 于光治疗。藻类养殖及藻红蛋白纯化的高成本已成为藻红蛋白在医药和工业领域广泛应用 的重要制约因素。本论文从紫球藻(Porphyridium 选，藻红蛋白p亚基基因的克隆，该亚基基因在巴斯德毕赤酵母中进行胞内和分泌表达等 方面开展研究。主要实验结果如下： 采用酚仿法、蛋白酶K法、盐析法、CTAB法和改良SDS法五种方法分别对紫球藻基 因组DNA提取，结果显示提取的基因组DNA大小均约23 kb，五种方法所提的DNA纯度 PCR扩增和酶切效果，CTAB法是五种方法中最适合紫球藻基因组DNA提取的方法。 分别提取紫球藻(Porphyridium 因编码区无内含子序列。 获得紫球藻藻红蛋白B亚基eDNA片段，插入至巴斯德毕赤酵母表达系统胞内表达载 15中，用MD 体pPIC3．5K及分泌表达载体pPIC9K中，电转化整合至感受态毕赤酵母GSl 和MM培养基，筛选重组子，G418筛选出高拷贝整合菌株，甲醇诱导培养96小时后， 的重组蛋白，与紫球藻藻红蛋白p亚基分子量大小一致。 关键词紫球藻，藻红蛋白13亚基，基因克隆，基因表达 中文文摘 中文文摘 紫球藻(Porphyridium 业领域的需求增大，高额的海藻养殖成本以及藻红蛋白纯化费用已成为藻红蛋白广泛应用 的一个重要制约因素。加强藻红蛋白基因结构、基因功能的研究，对阐明光合作用分子机 制、质体起源与进化等重大的理论以及与提高光合效率进而提高作物产量等实际问题都具 有重要的理论和实践意义。另外利用发酵生产藻红蛋白，提供食用和饲料蛋白，及利用藻 胆蛋白基因对大型经济海藻蛋白质性状进行基因工程改良，都需要藻胆蛋白基因结构和功 能研究的进展和突破。 紫球藻细胞富含多糖和藻红蛋白等次生代谢产物，因而紫球藻基因组DNA提取的关键 步骤之一就是这些物质与基因组DNA的分离，使其DNA释放到抽提缓冲液中，此外还 要考虑次级代谢产物及其相关酶类等杂质的影响。本研究根据所选材料的特点，选取广泛 应用于植物及真菌DNA提取的五种方法进行比较。结果显示提取的基因组DNA大小均约 23 基因组DNA提取的方法。 近十几年来，藻红蛋白分子生物学的研究进展较快，到目前为止，已对十几种藻的藻 红蛋白基因进行了克隆和序列分析，其中主要是来自红藻和蓝藻。本研究是通过从NCBI Premier 比对，得到紫球藻藻红蛋白p亚基基因两侧保守序列。利用生物软件Primer5．0和 Oligo 区．rpeA；对紫球藻藻红蛋白p亚基基因组结构分析表明，其基因编码区无内含子序列，由 紫球藻藻红蛋白p亚基cDNA序列推导出的氨基酸序列共由177个氨基酸组成。含有红藻 藻红蛋白 B 亚基与色基结合部位极为保守氨基酸序列 序列即为紫球藻藻红蛋白p亚基基因。 Ⅳ 中文文摘 的二级结构可知该亚基的二级结构含有68．93％a．螺旋和20．9％无规则卷曲结构。 I、BamH EcoRI、BamH I I双酶切后回收酶切产物，把回收的该片段插入至同样用EcoR 性内切酶EcoRI、Not simple载体上的紫球藻藻红蛋白p亚基基因 I双酶切隆在pMDl9．T