柴胡皂苷-d防肾小球硬化的体外实验研究.pdfVIP

中固协和医科人学侦Ij研究生论文 【中文摘要】 第一部分大鼠肾小球系膜细胞原代培养和鉴定 F1 的 cell，MC)，用免疫细胞 从SD人鼠分离、培养肾小球系膜细胞(Mesangial 化学的方法进行鉴定。 方 法 取SD大鼠麻醉后，在无菌条件下，取出肾脏，分别过80月、150目筛网， 边研磨边冲洗，在200目筛网上收集肾小球，用IV型胶原酶消化20分钟，20％ 胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心后用含有胰岛素的20％胎牛血清的 DMEM培养液悬浮肾小球，在5％C02培养箱中培养。用抗Actin单克隆抗体、 学染色鉴定。 结 果 原代培养的第3天有50--80％的肾小球贴壁，5天后肾小球上皮细胞开始 爬出来，一周后上皮细胞逐渐死亡；同时系膜细胞从肾小球中长出。在20天左 右，系膜细胞会满布瓶底。倒置显微镜下观察系膜细胞呈梭形。中央有一清晰的 卵圆形的细胞核，核周胞质散布大量的细小颗粒，胞质向外伸出长短不一的突起。 vWF均为阴性。原代培养的系膜细胞可传代培养至25代，细胞生长旺盛，状态 良好。 结 论 该方法培养出的细胞经过鉴定除外肾小球其他固有细胞，证实是系膜细胞。 其生长旺盛、形状稳定，可以用于实验研究。 Ill 中困协和医科人学颂f：研究生论文 第二部分 柴胡皂苷_d对大鼠MC增殖抑制作用及其机理的研究 日 的 刺激下肾小球系膜细胞增殖的影响，通过观察柴胡皂苷．d对系膜细胞细胞周期、 调亡、细胞素依赖蛋白激酶4(CDK4)表达的影响，探讨其对系膜细胞增殖抑 制作用的可能机理。 方 法 10．0 og／m1)对系膜细胞增殖的影响：用MTT法检测O．25％DMSO、Lps0I_tg／ml、 Lps5．0鹇／Inl和柴胡皂苷-d(0、O．25、O．5、1．0、2．0、4．0、8．0lag／m1)作用48 小时对系膜细胞增殖的影响：用LDH释放实验检测柴胡皂苷．d的细胞毒作用； 取对数生长期的系膜细胞，接种于6孔板，加入含柴胡皂苷一d(O、1．0、2．0、4．0 p．g／m1) 5．0 及Lpsp．g／ml作用48小时，流式细胞仪检测细胞周期及调亡：用免疫细胞化学 方法观察柴胡皂苷．d对系膜细胞CDI4表达的影响。 结 果 5．0-tg／ml、10．0Mg／ml Lps刺激系膜细胞后，系膜细胞都明显增殖(P0．05 I_lg／ml一8．0pg／ml柴胡皂苷一d 或PO．01)。5,0峙／mlLps可造成系膜细胞增殖，O．5 放实验检测8．0 2．0、4．0 Mg／m1)可使Gl期的MC数增加，S期细胞数下降，并能诱导系膜细胞调 亡(PO．05或P0_01)。4．0 lag／ml柴胡皂苷一d抑制CDK4的表达。 结 论 SSd可通过促进细胞凋亡，并且能通过抑制CDK4的表达，阻止细胞进入S 期，无法进行有效的细胞周期循环，从而抑制了MC的增殖。