流式细胞术应用概述解读.ppt

流式细胞术应用概述 流式细胞术的一般介绍 什么是流式细胞术？ 流式细胞仪(Flow Cytometer): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM): 是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。 流式细胞仪特点 多参数测量和分析（散射光和荧光）； 快速测量和分析 每秒可达1000-10000个细胞 分选纯度可达99%以上。 获取的数据分析结果更具有统计学意义； 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒 FACSCalibur 流式细胞仪分析图谱 SSC（侧向散射光）--反应细胞内颗粒多少 流式细胞术在临床检测和科研中的应用 1、细胞表面分子标记（以淋巴细胞亚群检测为例） 原理 人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。 T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞两个亚群； B淋巴细胞特异性标志为CD19； NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3 利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进而得到各亚群的比例。 标本来源 （1）外周血 （2）骨髓穿刺液， （3）骨髓活检标本 （4）淋巴组织穿刺 样本保存 要 求： 室温条件(16℃ -28℃ )存放； 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液体（如 生理盐水或组织培养液）。 保存时间 肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为48～72小时； EDTA抗凝标本，存放时限只有12 ～ 24小时，因为髓细胞在此条件下会裂解； 柠檬酸（ACD）抗凝的外周血标本可存放72小时以上。但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本，因为高浓度的ACD会引起pH值变化而导致骨髓细胞死亡 正常骨髓流式分析图 CD45/SSC 图中可见： CD45 强阳性SSC 低信号的细胞群为淋巴细胞(褐色细胞群体) 中等强度的CD45 表达SSC 信号最强的细胞群体为粒细胞(蓝色及红色细胞群体) CD45 表达与SSC 信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体(绿色细胞群体) CD45 阴性SSC 信号最低的有核红细胞和细胞碎片 根据骨髓细胞CD45/SSC 图中分布情况设门圈定各类细胞 R1 门为成熟淋巴细胞 R2 门为正常单核细胞位置 R3 门正常粒细胞位置 R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置 R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置 R6 门为幼稚髓细胞出现位置 白血病细胞通常会在R4 R6 两门位置处出现 3、网织红细胞血小板检测 计数外周血中检测网织红细胞和网织血小板 4、血小板自身抗体检测 血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。 5、血小板功能分析 血小板活化实验 6、夜间阵发性血红蛋白尿 白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。急性白血病的分型基本上分三个阶段： FAB分型(1976) (morphology，M ) MIC分型（1986） (morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C ) WHO分型(2001) （MICM） (morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C) (molecular biology, M) 急性白血病分型历史 急淋 （ALL） 急性白细胞FAB分型 急非淋 （ANLL） 急性髓细胞白血病(AML) L1型 L2型 L3型 M0: 微分化型髓系白血病； M1：未分化的原粒细胞白血病； M2：部分分化的原粒细胞白血病； M3：急性早幼粒细胞白血病； M4：急性粒、单核细胞白血病； M5：急性单核细胞白血病； M6：急性红血病或红白血病； M7：急性巨核细胞白血病。 MIC分型以形态学为基础、免疫学和细胞遗传学作补充，相互结合，使分型更趋精确。其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。 MIC分型 形态学 (morphology， M ) ：传统的骨髓片检查 免疫学 (immunology， I ) ：免疫组化 流式细胞术 细胞遗传学 ( cytog