亚洲璃眼蜱功能因的克隆、表达和免疫效果分析.pdfVIP

摘要 目的意义：蜱是动物体表的一类常见吸血节肢动物，能够传播多种疾病，如原 虫病、细菌病、病毒病等，其所带来的危害不仅给畜牧业生产和人类健康构成了极大 挑战，也造成了巨大的经济损失，故此蜱的控制已经成为广大研究者共同关注的课题。 我国目前有100多个蜱种，亚洲璃眼蜱主要分布于我国西北部的荒漠地区，主要传播 新疆出血热。 目前对蜱的控制主要使用化学杀虫剂。然而，随着蜱抗药性以及畜产品的药物残 留等问题的出现，寻找新的抗蜱方法就显得尤为重要。相对于化学杀虫剂来说，免疫 预防被认为是一种最有前途的控制蜱的方法，而大量具有免疫作用的功能基因的发现 是这种方法实现的前提。故此，本研究以从本实验室建立的亚洲璃眼蜱雌蜱未吸斑和 半饱(吸血5天)状态的唾液腺基因表达差异建立的消减文库中筛选出的两个新基因 克隆、体外表达及免疫工作以分析其功能，为蜱和蟀病的控制作一些探索。 方法及结果：首先运用生物软件分析两个EST片段(据测序号分别命名为1-6和 为APl8；另一基因片段(命名为B12)具有典型的基因3’端特征，而5’端缺失，故根 转化大肠杆菌DH5Ⅱ和测序。根据测序结果，设计基因特异性引物用于扩增全长基 PCR产物经纯化、连接、转化和测序分析，结果得到B12全长基因序列，该基因开 正式定名为AP27。利用软件和生物信息学网站进行两个基因功能的初步预测，结果 显示两个基因均为新基因，其中APl8可能为蜱体内的一凝血肽；AP27可能与基因的 转录作用相关。 取亚洲璃眼蜱雌蜱的未吸血成蜱的唾液腺和半饱血成蜱不同部位包括壳、唾液腺、肠 时的唾液腺中均有表达，而在未吸血蜱的唾液腺中不表达：且在壳中的表达丰度相较 略低。 三个系统中均未能成功表达。故重点分析APl8基因重组蛋白的功能：将APl8臃T32a 重组蛋白纯化后作为抗原三次免疫小鼠，ELISA实验测定抗体效价变化，选择出其中 效价最高的抗血清，进行westernblot分析，对比识别亚洲璃眼蜱成蜱吸血和未吸血 状态的天然唾液腺抗原，结果发现抗蜱唾液血清可以识别半饱血雌蜱的唾液腺蛋白， 而未吸血状态的唾液腺抗原则不能被识别。 结论：本研究成功地获得了亚洲璃眼蜱的两个新基因的全长，证明这两个基因为 亚洲璃眼蜱因吸血诱导唾液腺发生差异表达的基因；也证明了基因来源的消减文库的 成功性和可靠性；经原核表达的APl8重组蛋白具有一定的免疫原性，为抗蜱综合疫 苗的研制提供了参考。 关键词：亚洲璃眼蜱克隆表达消减免疫基因功能 Abstract Aim：Ticksare thatinfest animalsand are obligate domestic fowls．They ectoparasites the vectors a number ofhumanand significant great of animals， transmitting pathogens suchas and causesnot a parasitic only arboviruses，rickettsiae，spirochetesprotozoa,which economic alsoamass to and great loss,but production challengestockbreeding 100kindsof werefoundin health．At t