必威体育精装版大肠杆菌质粒和噬菌体.ppt

转化（transformation） ◆ 重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。 ◆ 宿主细胞也称为受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。 ◆ 原核细胞以大肠杆菌为主，真核细胞包括酵母及动物细胞等。 ◆ 在基因克隆技术中，转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量的扩增。  转化及感受态细胞 ★ 目前常用的原核细胞转化方法有两类： 电穿孔转化法、化学转化法 ★ 电穿孔转化法属于物理方法，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。 ★ 化学转化法原理： （1）低温（0℃）和CaCl2低渗溶液处理，使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态。菌体膨胀成球形，细胞壁和膜通透性增强。 （2）DNA与Ca2+形成的羟基-磷酸钙复合物黏附于菌体表面，42℃短暂热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组DNA被吸收进入宿主细胞。 （3）在营养丰富的培养基上生长1小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。 挑取单菌落，接种无抗菌素的LB培养基，37℃摇床培养过夜。 次日按1：100转种新鲜LB培养基，继续摇床培养2小时左右，至菌液OD 600nm值为0.4-0.6时停止培养。 置冰上预冷10分钟，然后4℃、5000rpm离心10分钟，弃上清； 以10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，放置于冰浴中20分钟； 4℃、5000rpm离心10min，弃上清； 按每50ml培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2的比例重悬细胞沉淀，再加入15%体积灭菌甘油，混匀，然后分装于Eppendorf管中，-70℃低温冰箱中保存。 感受态宿主菌的制备 氯化钙法 1．前夜接种受体菌（DH5?、DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6； 3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5．4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6．弃去上清，加入1500?l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 7．4℃下3000g冷冻离心5分钟 8．弃去上清，加入750?l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 9．4℃下3000g冷冻离心5分钟 10．加入20?l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11．立即使用或迅速置于-70oC超低温保存。 感受态宿主菌的制备 电转化法 感受态宿主菌的制备 注意事项 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 ．所使用的器皿必须干净。去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比； ● 取100μl感受态细胞悬液(化冻后马上进行下面的操作)，加入适量质粒DNA。 ● 轻轻摇匀，冰上放置30min[（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于DNA-Ca2+吸附于细胞表面；（3）防止DNAase降解DNA]，42℃水浴中保温1-2min[使细胞摄入吸附于其表面的DNA]，然后迅速冰上冷却2min。立即向管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约60min，使受体菌恢复正常生长状态。 ● 培养液0.1ml，接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀。 ● 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 转化步骤 转化结果分析 噬菌体 噬菌体概述 噬菌体概述 噬菌体：感染细菌、真菌、放线菌 或螺旋体等微生物的细菌