研究生分子生物学实验..pptVIP

2. Gel bed can be made by sealing a proper sized plastic with the masking tape and inserted the comb （胶带封闭胶床，插梳子） 3. Cool agarose gel to 60℃, add 5μl EB, mix, pour the agarose slowly (avoid bubbles) onto the gel bed （冷却，加EB混匀，倒入 胶床） 4. Let gel polymerize for about 30min, discard the masking tape, place the gel bed onto the electrophoresis tank, remove the comb （30min后，撕去胶带，放入电泳槽，拔出梳子) 5. Fill the tank with proper amount of TBE buffer, usually the buffer is about 1 mm above the gel （加入TBE buffer，让液面略高于胶面） 6. Add 2μl loading buffer and 7μl sample onto a piece of parafilm, mixed, add DNA sample slowly with the pipette tip just beneath the opening of the well (avoid bubbles in tip)（上样） 7. Electrophoresis (80mA) about 30min （恒流80mA，电泳30min） 8. Observe DNA fragments under UV light （紫外灯下观察结果） 目的基因686bp,蛋白分子量34kd 质粒提取 1、离心收集3ml培养液中的菌体，用250ul重悬液 重悬菌体。 2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。 3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离心10分钟。 4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分钟，弃去收集管中溶液。 5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm  离心1分钟，弃去收集管中溶液。 6、加入250ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。 7、10000rpm离心2分钟，弃去收集管中溶液。 8、将离心柱转移到干净1.5ml EP管中，加入 30-50ul去核酸酶水到离心柱上，10000rpm 离心1分钟，收集EP管中样品。 重组子的筛选和鉴定 （一）根据载体的性状变化进行筛选 1. 根据载体的抗药性标记进行筛选 insert 载体上的抗药基因： 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 抗卡那霉素基因等 凡是转入了载体的细胞都获得了这种 抗药性，可以在平板上生长菌落 2. 根据载体抗药性插入失活选择 根据载体抗药性标志插入失活选择 含有两个以上的抗药性基因的选择，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。 外源基因 抗Amp 抗Tet 抗Amp 抗Tet 抗Amp 抗Tet 重组DNA 空载体 不含有载体或重组DNA 3 β-半乳糖苷酶系统（蓝白斑） β-半乳糖苷酶系统 载体：pUC、pGEM系列载体等 带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码β-半乳糖苷酶基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能 当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（成为α互补），产生具有酶活性的蛋白质（ β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈蓝色。 当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无α互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色。 * * 分子生物学实验 颜景芝 2012.12 大鼠晶体βB2蛋白基因RT-PCR及转化噬菌体表达 实验一 RT-PCR 实验二 细菌的转化、重组子的筛选及 PC