生物工业下游技术细胞破碎..pptVIP

生物工业下游技术的一般流程 第四章 细胞破碎 细胞壁的结构与组成 细胞破碎技术 破碎率的测定 破碎技术的研究方向 基因工程包涵体的纯化方法 概述 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。 细胞壁的结构与组成 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 酵母菌 霉菌 肽聚糖的结构 细菌 细菌 而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细胞壁成分的10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。 细菌 细菌 破碎细菌的主要阻力 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 酵母菌 酵母菌 破碎酵母细胞壁的阻力 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 霉菌 各种微生物细胞壁的结构和组成 细胞破碎方法 机械法 珠磨法（Bead mill） 高压匀浆破碎法（High-pressure homogenization） 超声波破碎法（Ultrasonication） X-press法 非机械法 酶溶法（Enzymatic lysis） 化学渗透法（Chemical permeation) 渗透压法（Osmotic pressure） 冻融法（freezing and thawing） 干燥法（Dryness） 珠磨法 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机（High speed bead mill）。 工作原理：进入球磨机的细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂和氧化铝等研磨剂一起快速搅拌和研磨，通过剪切和碰撞作用，使细胞破碎，释放出内含物。 在珠液分离器的协助作用下，研磨剂被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 珠磨法 影响因素：珠体直径、珠体装量、细胞浓度、料液性质、研磨时间、搅拌速度和操作温度等。 提高细胞破损率：延长研磨时间、增加珠体装量、提高搅拌速度、提高操作温度。 特点：1. 具有破碎和冷却双重功能，产物不易失活；2. 一次操作即可达到较高的破碎率；3. 适合各种微生物细胞的破碎；4.操作参数多，不易控制，不适合大规模操作。 高压匀浆法 工作原理：细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 高压匀浆法 破碎的动力学方程： ln[1/(1-R)]=Ktnpa R — 破碎率； Kt － 与温度有关的速度常数； n － 悬浮液通过匀浆器的次数； P － 操作压力，MPa； ɑ－ 与微生物种类有关的常数。 高压匀浆法 影响因素：温度、压力和通过匀浆器的次数。 升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。 Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175MPa的压力下，破碎率可达100％，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。 高压匀浆法 特点： 1. 操作参数少，易控制，适合大规模操作； 2. 需循环多次才能达到较高的破损率； 3. 不适合丝状真菌和含包含体的基因工程菌的破碎，适合于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20%左右。 超声破碎法 超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的超声波处理细胞悬浮液。 超声波