生物工程制药之基因工程制药..pptVIP

基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 疏水层析 4）疏水层析对蛋白复性的基本原理 变性蛋白进入疏水层析柱后，变性蛋白瞬间失去水分子，形成局部疏水环境以利于蛋白分子形成疏水核，并从疏水核开始折叠。随着流动相的不断变化，变性蛋白逐渐得以复性，最后被洗脱下来。 并不针对发生不可逆变性的蛋白。 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 1）亲和层析（affinity chromatography,AC）是利用固定化配体与目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既特异又可逆，改变条件可以解除这种结合。 2）亲和层析的原理 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质（载体）上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体与载体共价结合，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 蛋白质生物特异性可以帮助选择特异性的配体，一般目的蛋白与配体结合而不保留杂质，要选择亲和力适中而特异性较强的配基，其解离常数要求在10-8~10-4mol/L 。 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 3）亲和吸附剂（载体） ①良好的理化稳定性 ②较多的化学活性基团，能与配体稳定共价结合，并且在结合后不改变基质与配体的基本性质。 ③多孔立体网状结构，使被吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度。 ④高亲水性的惰性物质，减少非特异性吸附，同时使生物分子容易接近。 ⑤良好的机械性能以及颗粒的均一性。 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 4）常用亲和吸附剂（载体） ①纤维素：无定性微纤维、微晶纤维素和球状纤维素等。 ②琼脂糖凝胶：由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。商品主要有：Sepharose2B, Sepharose4B, Sepharose6B (pharmacia), Utralgels A-2、A-4、A-6 Sepharose CL（2，3-二溴丙烷处理的琼脂糖） ③聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺与甲叉双聚丙烯酰胺聚合物） 商名品：Biogel-P ④其它： Utralgels ACA等。 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 5）配体 理论上，亲和层析的任何一方都可以作为配基，作为配基的理想配体一般满足条件： ①与待分离物亲和力适当 ②与待分离物特异性较强以保证较高分辨率 ③与载体稳定结合，并在结合后结构无明显变化 ④较稳定，尽可能重复使用。 分为： 特异性配体 非特异性配体 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 6）载体的活化 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 7）配体与载体的偶联 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 8）操作过程 上样：①慢（上样速度要慢；平衡过程慢；可以多次上样） ②缓冲液离子强度适当 ③上样温度较低 洗脱：分为特异性洗脱和非特异性洗脱 特异性洗脱：可以用与配体有亲和力的洗脱物质进行洗脱；也可以与目的产物有亲和力的洗脱物质进行洗脱。 非特异性洗脱：改变外界条件，包括洗脱液pH、离子强度和温度等因素，降低目的产物与配基亲和力而将之洗脱下来，上述条件的选择以不使产物丧失活性为根本原则。 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 亲和层析（p56） 9）金属螯合层析（Chealting AC） 一般采用环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合剂（如EDTA、二亚氨二己酸、氨基水扬酸、8-羟基喹啉等）偶合成配基，再用金属离子处理（如Ni2+、Zn2+、Cd2+等），制成金属螯合层析柱，一些含有His、Cys、Trp、Phe的蛋白质可以用上述层析方法进行分离纯化，也可以用于寡聚核苷酸等分离。 基本处理方法：将环氧型琼脂凝胶膨胀洗涤→将亚二氨二醋酸钠溶于4mol/L的Na2CO3→将该溶液加入凝胶，65℃反应24h→蒸馏水洗涤凝胶→装柱→金属盐溶液缓慢过柱（如1mg/ml的ZnCl2） 基因工程制药 3.7.4 重组蛋白的分离纯化 凝胶层析（p56） 1）凝胶层析（ Gel Filtration Chromatography,GFC）又称分子排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小进行分离的液相层析方法。凝胶层析主要是依据分子的大小来进行分离纯化的，它是将样品混