微生物工程第四组..pptVIP

工程酿酒酵母从头生产黄酮类化合物：柚皮素 第四组 纲要 1、研究背景及目的 2、研究原理▲ 3、研究方法及结果分析▲ 4、讨论▲ 5、研究进展及展望 黄铜类化合物简介： 黄铜类化合物广泛存在与植物体内，有重要的生理活性，近年来研究其具有多种药理活性：?对心脑血管系统具有保护作用，如金丝桃苷对缺血性脑损伤有保护作用、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；?抗菌及抗病毒活性；?抗肿瘤活性；④大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基作用，⑤抗炎、镇痛、保肝作用等。 一、研究背景及目的 黄酮类化合物是植物次生代谢产物，表现出各种各样的抗氧化能力等药理活性与人体健康相关，包括 癌症、糖尿病、肥胖症和帕金森氏病 等。 植物生产类黄酮具有低生产率、由于其分子的复杂性分离提取困难等特点；因此，为了克服这些限制，在代谢工程中，设想利用微生物系统的特定代谢途径来生产大量的单一分子。 二、▲研究原理及方法 （一） 在酵母中工程化生产柚皮素途径的原理示意图： 拟南芥相关基因过表达：PAL1（苯丙氨酸解氨酶），C4H（肉桂酸4 -羟化酶），CPR1（细胞色素P450还原酶），4CL3（4 -香豆酸辅酶A连接酶），CHS3（查耳酮合酶）和通道1CHI中 （查耳酮异构酶）和荚膜红细菌一个基因; TAL1（酪氨酸丙氨酸解氨酶）。 虚线表示的反馈抑制。 灰色箭头表示 酵母生产苯乙醇的途径。 大的深灰色箭头表示柚皮素的生产途径。 拟南芥 Aro3/Aro4：3 -脱氧-D-阿拉伯- heptulosonate -7 -磷酸盐（DAHP）合酶，PDC1，5，6; 丙酮酸脱羧酶，Aro10; 苯丙酮酸脱羧酶。 研究的目标是规定一种代谢工程策略：用葡萄糖作为唯一碳源,由啤酒酵母 从头生产柚皮素。 基因的选择（关键） 选取几个在酵母柚皮素途径中异源表达的几个基因：黄铜类生物合成基因4CL3、CHS1 、 CHI1以及源于木质素的 C4H和PAL1 基因。而PAL1和CHI1分别优于PAL2与CHI3, 因为它们的表达模式与C4H和4CL3有更强的相关性。 拟南芥候选基因A中黄酮类化合物生物合成的共表达分析 ：。 实线表示的表达高于0.7皮尔逊相关系数，虚线表示0.6和0.7之间的皮尔逊相关性。 三、实验方法及结果分析 1、橘皮素基因的构建与评价 构建的优化后的酵母菌株为IMU011（质粒pUDE172） 在含有以葡萄糖为唯一碳源合成培养基的摇瓶培养，该菌株产生的橘皮素浓度在5.4μM（见后图）。柚皮素浓度在细胞外测定得到，但其运输机制尚未阐明。 2、酵母中酪氨酸的减轻对DAHP的反馈抑制调节 构建酿酒酵母菌株为IMX183； 特点：将酪氨酸不敏感等位基因ARO4与其缺失了DAHP合酶（ARO3）等位基因结合地导入受体菌能够引起芳香族氨基酸的四倍产量。 目的：测试这种遗传干预对柚皮素合成的潜在影响。 测试结果：使得摇瓶中柚皮素滴度的2倍增加（10.4μM），这种增长是伴随着苯乙醇的积累，其胞外浓度增加约100倍的水平，为柚皮素浓度20倍甚至更高。 3、消除竞争性苯丙酮酸脱羧酶活性 机制：苯丙酮酸脱羧酶依赖的2 - 氧代酸焦磷酸硫胺素可通过ARO10，PDC1，PDC5和PDC6编码。本文研究人员证实：PDC1和PDC6对苯丙酮酸的亲和力和脱羧速率比PDC5，尤其是Aro10低得多。（考虑到葡萄糖的利用） （1）构建了含有PDC1、aro10的酿酒酵母菌株：IMX185 （2）构建了含有PDC1的酿酒酵母菌株：IMX106 （○）IMU011（atPAL1↑，coC4H↑，coCPR1↑，atCHI1↑，atCHS3↑，at4CL3↑），（●）IMX183（aro3ΔARO4 G226S atPAL1↑，coC4H↑，coCPR1↑，atCHI1↑，atCHS3↑，at4CL3↑ ），（□）IMX185（aro3ΔARO4 G226S PDC5Δ，PDC6Δ，atPAL1↑，coC4H↑，coCPR1↑，atCHI1↑，atCHS3↑，at4CL3↑），（■）IMX106（aro3ΔARO4 G226S aro10Δ，PDC5Δ ，PDC6Δ，atPAL1↑，coC4H↑，coCPR1↑，atCHI1↑，atCHS3↑，at4CL3↑），（Δ）非柚皮素生产标准株CEN.PK2-1C。 误差线表示标准偏差。 4、减轻香豆酸在下游的瓶颈 机制：柚皮素查耳酮合酶通过催化缩合香豆酰-CoA与丙二酰辅酶A形成三个分子的查耳酮，它是已知的具有低催化活性的酶。因为在下游反应中香豆酸限制了柚皮素的产生。 将两个coCHS3基因的拷贝引入IMX106的质粒（pU