实验六IPCR扩增技术..pptVIP

实验六、PCR扩增技术 （8学时） 1. Taq 酶的特点和作用原理 2. PCR 体系的组成及其作用 3. PCR特异引物的设计 4. PCR 仪器的使用 5. PCR 反应的设置 6. PCR 结果的电泳检测 时间安排 1、介绍PCR扩增技术的原理 2、转化子的菌落PCR筛选（此两步共4学时） 3、PCR 结果的电泳检测 4、转化子的酶切鉴定（此两步共4学时） PCR的定义：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…... Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。 1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。 PCR的发展史 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 PCR的原理 标准PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物 各200μmol/L 引物 10～100 pmol 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 2.5 u （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素 引物 （primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 引物包括正向（F）和反向（R）引物 引物设计的原则 1、引物长度：16-30个碱基，常为20个碱基左右。 2、引物碱基组成：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布，尤其在3‘端不应存在连续3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补，而影响PCR的特异性。 可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm＝4(G+C)+2(A+T)。 4、避免引物内或引物间出现二级结构或引物间互补 避免两引物间互补，特别是 3`端 5、引物 3`端的碱基要求严格配对 引物3端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3端A影响最大，因此，尽量避免在引物3端第一位碱基是A。引物3端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。 6、引物5‘端对扩增特异性影响不大, 引物中可以加上合适的酶切位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等 7、引物的特异性 所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。 8、两引物的Tm值接近 9、简并引物应选用简并程度低的密码子 例如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 dNTP 的质量与浓度 dNTP使用注意： 1)保存：使用时