苹果铁高效基因生物技术的研究——铁高效基因的克隆.pdf

摘要 本实验以小金海棠为试材，利用改进的SDS一苯酚法提取到高质量的根系 总RNA，然后通过mRNA差异显示技术获得了69条差异条带。将这些差异带 回收再扩增后，进行反向Northern杂交排除假阳性差异带。通过检验，共获得 阳性克隆7条。其中，有2条在缺铁胁迫下表达量增加，有5条为缺铁胁迫下 Vector Cat．#A3600)试剂盒将这7条 特异表达的。用pGEM．T SystemJ(Promega 进行筛选；每条差异带随机挑选8个白斑提取质粒进行测序，并对结果通过 GENBANK进行同源性比较，得到了差异片断的序列及其同源信息。 反向Northern杂交铁相关基因 关键词：小金海棠 mRNA差异显示 基茵每列 √ ／ V 夭 Abbreviation aa Aminoacid Base bp pair cDNA DNA Complementary DEPC Diethylpyrocarbonate DNA acid Deoxyribonucleic EB Ethidiumbromide aceticacid EDTA domineer Ethylene kb Kilobase kD KiloDalton 0．D Opticaldensity Oligo(dT) acid Oligodeoxythymidylic SDS Sodium sulfate dodecyl 1Hs 2 前言 铁是植物必需营养元素之一，是植物体内各种氧化还原酶、光合作用、呼 吸作用及电子传递过程中多种酶的重要组成部分，同时还是叶绿素的组成成分； 所以，铁在植物体内具有不可替代的作用，为植物生长拉育所必需。植物缺铁 表现为叶片黄化，其典型症状为叶肉组织变黄，叶脉仍然保持绿色：缺铁严重 时还影响了作物的产量和品质，甚至导致植物死亡(Mordert，1991)。 植物能吸收利用的铁必须以可溶性Fe(11)化合物形态存在。但在石灰性 and Chwab，1982)，且铁以难溶的 土壤中，可溶性铁的浓度仅为10‘11M(Lindsay and Fe(III)化合物形态存在，这远不能满足植物的生长发育需求(Romheld 壤占世界土地面积的1／3以上，所以植物缺铁失绿症是一个困扰整个世界农业 的难题(Cochen，etal，1997)。 至今，植物营养工作者为矫治植物缺铁失绿症进行了大量的探索。自从 1845年发现植物缺铁失绿症以来一个多世纪的实践已经证明，传统的采用物质 投入为主的“资源路线”来矫治植物缺铁失绿症费时费力、代价